Summary
大人のゼブラフィッシュの内耳感覚上皮は成人脊椎動物で有毛細胞の再生のメカニズムを理解するための良いモデルシステムです。このプロトコルは、我々は、細胞と細胞内レベルでの再生イベントを研究するための組織サンプルを取得できるような上皮の微細な解剖を、示しています。
Abstract
内耳の感覚神経上皮は、聴覚やバランス機能のための重要な構造です。有毛細胞（HCS）と支持細胞（SCS）：そのため、主に細胞の2つの型で構成された上皮の細胞および分子の機能を理解することが重要です。ここでは、上皮構造が高度に調査したすべての脊椎動物で保存されているので、大人のゼブラフィッシュではないだけに内耳感覚上皮を勉強するだけでなく、大人のゼブラフィッシュは、HCS、哺乳類は出生後まもなく失うことの能力を再生成することができるからです。我々は、HCの損失の結果として人間の聴覚/バランス赤字の臨床治療に役立つ可能性がある成人の脊椎動物の内耳HCの再生のメカニズムを研究するモデル系として成人ゼブラフィッシュの内耳を使用してください。
ここでは、成人のゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスと微細な解剖を行う方法を示します。総解剖は内耳の周囲の組織を取り除き、私たちは感覚上皮の詳細な構造を調べることができます組織切片を調製するのに便利です。細かい解剖では、個々の上皮の非感覚上皮組織をクリーンアップし、ホールマウント上皮サンプルで簡単に全体の上皮の不均一性を調べるために私達が可能になります。
Protocol
パート1：組織の準備
- バッファリングされたMS - 222（3 - アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩、0.03％）と成人ゼブラフィッシュを安楽死させる。
- 魚を刎ねる。 、下顎を切断し、最大腹側と解剖のパッドの上にヘッドを置き、虫ピンで組織を固定化する。頭蓋骨の腹側の軟部組織を削除し、解剖顕微鏡下で微細なピンセットで頭蓋骨のカプセルの腹側部分を開口割れ目。
- 4℃で一晩パラホルムアルデヒドで魚の頭（4％）を修正。
- 3回、5分ごとに時間（リン酸塩は1X、緩衝生理食塩水）をPBSで固定魚の頭をすすぎます。
パート2：内耳の総解剖
- 腹側を上にして解剖パッドに魚の頭を置きます。昆虫のピンとそれを固定する。すべての次の手順は、解剖顕微鏡下で実施されています。
- 細かいピンセットと、内耳を介して頭蓋骨の骨を削除してから、慎重に内耳組織を引き出す：saccules、lagenaの複数形、およびutricles。球形嚢およびつぼはしっかりとお互いに接続するため、卵形嚢（嚢およびつぼに前方）しながら一緒に引き出している、解剖中にもう一方の端の器官から切り離される可能性が非常に高くなります。
- PBS（1X）の内耳の組織を置く。これ以上の微細な解剖が必要ない場合は、PBS（1X）で組織を2〜3回リンスし、それが他の実験、例えば凍結切片に使用することができます。
パート3：内耳感覚上皮の微細解剖
- 細かい解剖は、清浄なスライドガラス上にPBS（1X）のドロップで行うことができる。
- 細かいピンセットの二組の卵形嚢から小嚢の耳石を外し、そして、必要に応じて、微細なピンセットと針の刃で上皮からの非感覚上皮組織と神経支配を切り落とす。
- 可能な限りそのまま全体球形を保つことを試みる間、嚢状とlagenar上皮を分離する前にlagenar耳石を取り外します。腹側を上にしてPBSのドロップで組織を置きます。慎重に球形嚢およびつぼの間にカットして針の刃を使用してください。必要に応じて、過度の非感覚上皮組織と微細なピンセットと針の刃を持つinnvervationを切り落とす。
パート4：感覚上皮の有毛細胞の蛍光染色
- 3回、5分間ずつPBT（1XPBS、1％トリトンX - 100）と感覚上皮をすすいでください。
- と上皮をインキュベートfluophore標識ファロイジン（例えばAlexaの小麦粉488ファロイジン、1:1000希釈）を室温で30分間。
- 3回、10分間ずつPBTと感覚上皮をすすいでください。
- メディアのマウントをスライド上に上皮をマウントし、適切な波長のフィルターと蛍光顕微鏡下で染色した組織を確認してください。
- 成功した解剖と染色後、強力な有毛細胞束の染色と無傷の上皮を顕微鏡（図1）の下で見ることができます。
図1。嚢状感覚上皮の有毛細胞は、アレクサ小麦粉488ファロイジン（緑色）で染色した。ペーパーで説明したように組織サンプルを切除し、染色された。いくつかの画像はサンプルの異なる位置で撮影し、Adobe Photoshop 7.0と共に並べて表示されました。
スケールバー=150μm。
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Discussion
このプロトコルでは、我々は、私たちは、感覚上皮の細胞と細胞内機能を研究するための組織サンプルを準備することができる大人のゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスと微細な解剖を説明した。
成功した解剖を行うために、非常に最初のステップは、固定では、非常に重要です。古いソリューションは、解剖時に扱うことが困難な組織の下で、固定につながるので、常に作りたてのパラホルムアルデヒド溶液を使用していることを確認します。しかし、それは郭清後の免疫/組織染色の結果に干渉するので、あなたが、長すぎるために固定のソリューションでそれらを残すことによって組織を過剰修正しないことを確認してください。さらに、適切なサイズになってよく維持解剖ツールを使用すると、特に細かい解剖については、同様に重要です。
この総解剖のプロトコルは、組織特異的なDNAを/ RNAの/タンパク質の抽出に内耳の組織を取得するために適応させることができます。その場合には、解剖はパラホルムアルデヒド固定せずに右の魚の犠牲の後に行ってください。さらに、特定のルーチンのメソッドは、ターゲットの高分子の劣化を保護するために使用することができます。例えば、魚の頭は、（低顎除去）すすぐことができますし、組織特異的なRNA抽出のための解剖中にRNAlater中の溶液（Ambion社）に浸漬。
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Acknowledgments
この研究は米国立ヒトゲノム研究所、国立衛生研究所の学内研究プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Reagent | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) | Reagent | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12379 | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Dissection microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ1000 | |
| Insect pins | Tool | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Tweezers | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| Needle blade | Tool | Sharpoint | 78-6810 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| Dissection pad | Tool | eNasco | SB07840M | |
| Zebrafish | Animal | Various | n/a |
