Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Summary

O epitélio sensorial do ouvido interno zebrafish adultos é um sistema bom modelo para a compreensão dos mecanismos de regeneração das células ciliadas nos vertebrados adultos. Este protocolo demonstra a dissecção fina do epitélio, através do qual podemos obter amostras de tecido para estudar os eventos de regeneração em níveis celular e subcelular.

Abstract

Neurossensorial epitélio do ouvido interno são as estruturas cruciais para as funções de audição e equilíbrio. Portanto, é importante compreender as características celulares e moleculares do epitélio, que são compostas principalmente de dois tipos de células: células ciliadas (HC) e células de apoio (SCS). Aqui nós escolhemos estudar o epitélio sensorial do ouvido interno em zebrafish adulto não só porque as estruturas epiteliais são altamente conservada em todos os vertebrados estudados, mas também porque o peixe-zebra adulto é capaz de regenerar HCs, uma capacidade que os mamíferos perdem logo após o nascimento. Nós usamos a orelha interna do peixe-zebra adulto como um sistema modelo para estudar os mecanismos de regeneração interior HC ouvido nos vertebrados adultos que poderiam ser úteis para a terapia clínica da audição / déficits na balança humana, como resultado da perda de HC.

Aqui demonstramos como fazer dissecções bruta e multa de epitélios sensoriais do ouvido interno em peixe-zebra adulto. A dissecção macroscópica remove os tecidos ao redor do ouvido interno e é útil para preparar cortes de tecido, o que nos permite examinar a estrutura detalhada do epitélio sensorial. A dissecção fina limpa os tecidos não-sensoriais-epitelial de cada epitélio individuais e nos permite examinar a heterogeneidade do epitélio todo facilmente em todo o monte amostras epiteliais.

Protocol

Parte 1: Preparação do tecido

1. Euthanize o peixe-zebra adulto com buffered MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoato sal metanossulfonato, 0,03%).
2. Decapitar o peixe. Cortar o maxilar inferior, coloque a cabeça na almofada dissecção com o lado ventral para cima, e imobilizar o tecido com pinos de insetos. Remover o tecido mole ventral no crânio e se abrir a parte ventral da cápsula crânio com um par de pinças finas sob um microscópio de dissecação.
3. Fixar a cabeça de peixe em paraformaldeído (4%) a 4 ° C durante a noite.
4. Lavar a cabeça de peixe fixados em PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) por 3 vezes, 5 minutos de cada vez.

Parte 2: Gross dissecção da orelha interna

1. Coloque o peixe cabeça na almofada dissecção com o lado ventral. Imobilizá-lo com alfinetes de insetos. Todas as etapas seguintes são realizadas no microscópio de dissecação.
2. Com um par de pinças finas, remova o osso do crânio sobre o ouvido interno e, em seguida, puxe cuidadosamente para fora dos tecidos do ouvido interno: sáculos, lagenae, e utrículos. Sáculo e lagena são fortemente anexar ao outro e, assim, retirar juntos enquanto o utrículo (anterior ao sáculo e lagena), muito provavelmente a ser destacado da outra extremidade órgãos durante a dissecção.
3. Coloque os tecidos do ouvido interno em PBS (1X). Se não houver dissecção mais fino é necessário, lave o tecido 2-3 vezes com PBS (1X) e pode ser utilizado para outros experimentos, criosecções por exemplo.

Parte 3: dissecção fina do epitélio sensorial do ouvido interno

1. A dissecção fina pode ser realizada em uma gota de PBS (1X) em uma lâmina de vidro limpa.
2. Remover o otólitos do utrículo utricular com dois pares de pinças finas, e, se desejar, corte o tecido não-sensoriais epiteliais e da inervação da epitélios com um par de pinças finas e uma lâmina de agulha.
3. Remover o otólitos lagenar antes de separar sacular e lagenar epitélio, enquanto tentar manter o sáculo toda tão intacto quanto possível. Coloque o tecido na queda PBS com até lado ventral. Use a lâmina de agulha para corte cuidadosamente entre o sáculo e lagena. Corte o tecido não-sensorial excessiva epiteliais e os innvervation com uma pinça fina e da lâmina da agulha, se desejar.

Parte 4: coloração fluorescente das células ciliadas no epitélio sensorial

1. Lavar o epitélio sensorial com PBT (1XPBS e 1% Triton X-100) por 3 vezes, 5 min de cada vez.
2. Incubar os epitélios com fluophore marcado phalloidin (por exemplo, farinha Alexa 488 faloidina, 1:1.000 diluição) por 30 min em temperatura ambiente.
3. Lavar o epitélio sensorial com PBT de 3 vezes, 10 min de cada vez.
4. Monte o epitélio sobre uma lâmina com meio de montagem e verificar o tecido manchado sob o microscópio fluorescente com filtros do comprimento de onda adequado.
5. Após a dissecção de sucesso e coloração, epitélio intacto, com forte coloração feixe capilar célula pode ser visto sob o microscópio (Fig. 1).

Figura 1. Células ciliadas do epitélio sacular sensoriais foram coradas com Farinha Alexa 488 faloidina (Green). A amostra de tecido foi dissecada e coradas como mencionado no jornal. Várias fotos foram tiradas em diferentes posições da amostra e azulejos em conjunto com o Adobe Photoshop 7.0.
Barra de escala = 150μm.

Discussion

Neste protocolo, descrevemos a dissecção grossa e fina do epitélio sensorial do ouvido interno de peixe-zebra adulto, o que nos permite preparar amostra de tecido para estudar as características celulares e subcelulares do epitélio sensorial.

, A fim de realizar uma dissecação de sucesso, o primeiro passo, a fixação, é muito importante. Certifique-se que você sempre usa solução paraformaldeído preparados na hora, porque solução antiga resultará em menos de fixação de tecidos que são difíceis de lidar durante a dissecção. No entanto, certifique-se que você não sobre-fix os tecidos, deixando-os na solução de fixação por muito tempo, porque vai interferir com os resultados da coloração imunes / histológicas após a dissecção. Além disso, usando bem conservados instrumentos de dissecação que estão em tamanhos adequados é fundamental, bem como, especialmente para a dissecção fina.

Este protocolo dissecção macroscópica também pode ser adaptado para a aquisição de tecidos do ouvido interno para a extração de tecido específico DNAs / RNAs / proteínas. Nesse caso, a dissecção deve ser realizado logo após o sacrifício dos peixes sem fixação paraformaldeído. Além disso, certos métodos de rotina pode ser usada para proteger a degradação das macromoléculas alvo. Por exemplo, a cabeça de peixe (mandíbula-removido) pode ser lavado e, então, imersas na solução RNAlater (Ambion) durante a dissecção de tecidos específicos extração de RNA.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Reagent	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)	Reagent	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin	Reagent	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	Reagent	Vector Laboratories	H-1500
Dissection microscope	Microscope	Nikon Instruments	SMZ1000
Insect pins	Tool	Fine Science Tools	26000-40
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Tweezers	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Needle blade	Tool	Sharpoint	78-6810
Fluorescent microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Dissection pad	Tool	eNasco	SB07840M
Zebrafish	Animal	Various	n/a