Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии

Published: April 1, 2009 doi: 10.3791/1217

Summary

В этом видео мы продемонстрируем метод, при котором для анализа развивающихся мозга позвоночных в живых эмбрионов данио на одной резолюции ячейки с помощью конфокальной микроскопии. Это включает в себя метод, посредством которого мы вводим одноклеточного эмбриона полосатого данио, а затем смонтировать и изображение развивающегося мозга.

Abstract

В этом видео мы продемонстрируем метод нашей лаборатории разработаны для анализа формы клеток изменения и перестановки требуется согнуть и сложить развивающихся данио мозга (Gutzman и др., 2008). Такой анализ дает новое понимание основных клеточной биологии, необходимые для развития 3D-структуры мозга позвоночных, а также значительно увеличивает нашу способность к обучению нейронных морфогенеза трубки. Эмбрионального мозга данио формируется, начиная с 18 часов после оплодотворения (ФВЧ), а желудочки в нейроэпителия надуваться. К 24 HPF, первые шаги нейронных морфогенеза трубки являются полными. Использование метода, описанного здесь, эмбрионов на стадии одной клетки вводят мРНК, кодирующей мембраны ориентированных зеленый флуоресцентный белок (memGFP). После инъекции и инкубации эмбриона, в настоящее время от 18 до 24 HPF, монтируется, перевернутый, в агарозном и отображаемого с помощью конфокальной микроскопии. Следует отметить, что данио эмбрион прозрачной что делает его идеальной системой для флуоресцентной визуализации. Хотя наши анализы были направлены на средний мозг, задний мозг границы и задний мозг, этот метод может быть распространен для анализа любой регион данио на глубину 80-100 мкм.

Protocol

1. Подготовка мРНК для инъекций

  1. МРНК, используемых в этой процедуре расшифрованы с плазмидой, кодирующей CAAX-EGFP (memGFP) мРНК. Первый линеаризовать плазмиды в соответствии с Gutzman и др., 2008.
  2. Затем записать memGFP мРНК с использованием mMessage mMachine комплект.
  3. Развести в результате мРНК к 1μg/μl, Алиготе, и хранить при температуре -80 ° C.
  4. Подготовка литья под давлением в 1% агарозном с полосами шириной эмбрионов на одну ячейку стадии.
  5. За день до инъекции, созданная спаривания клетки разделяющая мужчин от женщин.
  6. В день инъекции, потяните капиллярных игл использованием съемника микропипетки подготовить для инъекций.

2. Потребители инъекционных мРНК

  1. В день инъекции, оттепель аликвоту 1μg/μl memGFP мРНК на льду.
  2. Развести мРНК 1:5 в воду, чтобы конечная концентрация 200ng/μl, и держать на льду.
  3. Нагрузка капиллярной иглой с 1 мкл подготовленных мРНК memGFP на 200ng/μl.
  4. Место загружены иглу в микроманипулятора придается газе microinjector.
  5. Отрегулируйте объемом впрыска до 1nl.
  6. Вытяните делителей на диких рыб типа создана в брачный клетки от предыдущего дня.
  7. Сбор эмбрионов, как только они проложены. Ориентировать их в форме инъекций агарозном покрыта зародыш среды (Уэстерфилд, 1995) с одной клетки на стороне от микроманипулятора.
  8. Inject через хорион и желток, что мРНК наносится непосредственно в одну ячейку. Inject примерно 50 эмбрионов в эксперименте. Не вводить, если ячейка разделена.
  9. Инкубируйте эмбрионов при 28 ° С в течение ночи в зачаточном состоянии среды

3. Монтаж и обработка изображений эмбрионов

  1. Для монтажа и изображения эмбрионов, удалить хориона щипцами из эмбрионов под стереомикроскопа за один час до времени достопримечательность.
  2. Подготовка слайдов для установки до 4-х эмбрионов.
    • Использование силиконовой смазкой для уплотнения вакуумных покровное на нижней специально разработанных 2 мм толщиной пластиковых слайдов с отверстием около 1 см в диаметре.
    • Заполните отверстие в слайд с 0,7% агарозы, и дать постоять около 20 минут или до закаленной
    • После агарозном укрепил, удалить небольшой плагин использовании 200 мкл наконечники для пипеток формировать цилиндрические отверстия, в которых для монтирования каждого эмбриона.
  3. Место эмбрионов на агарозном заполненный слайд при вскрытии микроскопом. Добавить 50 мкл tricaine (Уэстерфилд, 1995), чтобы обезболить эмбрионов.
  4. Используйте пинцет, чтобы положение эмбриона в цилиндрических отверстий в агарозном с мозгом или область интереса от основной покровное.
  5. Обложка эмбрионов в агарозном с другим покровное обеспеченных смазкой вакуумных силикона.
  6. Изображение эмбриона использованием перевернутой, люминесцентные, лазерное сканирование или вращающийся диск конфокальной микроскопии. Изображение на 63x или выше, чтобы собирать изображения высокого разрешения отдельных клеток в течение нейроэпителия.
  7. Изображения экспортируются в виде файлов формата TIFF с LSM программного обеспечения и проанализированы с помощью Photoshop.

4. Представитель Результаты / Результаты

Показанный на рисунке 1 является представителем конфокальной образ 24 HPF данио нейроэпителия между средний мозг и задний мозг желудочков. Каждая ячейка имеет метку с мембраной GFP.


Рисунок 1. Живая конфокальной микроскопии в memGFP впрыском 24 эмбрионов данио HPF.
(А) нейроэпителия из 24 HPF эмбриона с каждой ячейки намеченных GFP. Регион отображаемого отделяет средний мозг и задний мозг желудочков (M, H соответственно), образуя средний мозг, задний мозг границы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом видео мы продемонстрируем метод мРНК инъекции в одно эмбрионов данио клетки. Здесь мы используем мРНК, кодирующей мембраны ориентированных GFP на этикетке каждой ячейке. Затем показано, как монтировать и изображение развивающегося мозга в одной резолюции клетки. Этот метод позволил нам изучить новый тип ячейки меняют форму, базально-перетяжка, необходимых для формирования среднего мозга, заднего мозга границы (Gutzman и др., 2008). Подобный анализ других явлений, есть потенциал, чтобы значительно расширить наше понимание позвоночных морфогенеза и лежащий в основе клеточной биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Большое спасибо доктор Дженнифер Gutzman который первым разработал эту технику в Sive лаборатории. Спасибо также JB Зеленый в Dana-Farber института рака Boston, MA который любезно предоставил плазмиды, кодирующей CAAX-GFP мРНК. Конфокальной микроскопии было проведено в WM Keck Фонд фонда изображений Биологические на Уайтхеда. HS поддерживается NIHMH70926. Е. поддерживается NSF предварительно докторских стипендий.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Tags

Неврологии биологии развития выпуск 26 развитие мозга данио морфогенез микроинъекции одной инъекции клетки жить с изображениями конфокальной микроскопии эмбрион монтажа
Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Graeden, E., Sive, H. Live ImagingMore

Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter