Summary
このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。
Abstract
このビデオでは、我々の研究室が開発してゼブラフィッシュの脳（Gutzmanら、2008）曲げると折るために必要な細胞の形状の変更と再配置を分析するために開発した方法を示しています。このような分析は、脊椎動物の脳の三次元構造の開発に必要な基本的な細胞生物学の新たな理解物を得る、と大幅に神経管の形態形成を研究する我々の能力を向上させます。胚ゼブラフィッシュの脳は、神経上皮が膨らま内の心室として、18時間後に受精（HPF）で始まる形をしている。 24 HPFによって、神経管の形態形成の最初のステップは完了です。方法ここで説明を使用して、1細胞段階における胚をコードするmRNAの細胞膜をターゲットとする緑色蛍光タンパク質（memGFP）を注入されています。注射やインキュベーション、胚、現在18〜24 HPF後、アガロースで、反転、マウントされ、共焦点顕微鏡で撮像。特に、ゼブラフィッシュの胚は、その蛍光イメージングのための理想的なシステムとなって透過的です。我々の分析は、中脳後脳境界と後脳に焦点を当てているが、この方法は80〜100μmの深さにゼブラフィッシュで任意の領域の分析のために拡張することができる。
Protocol
1。インジェクションのmRNAの準備
- この手順で使用されているmRNAがコードするプラスミドCAAX - EGFP（memGFP）mRNAから転写される。最初Gutzmanら、2008によるとプラスミドを線形化する。
- その後mMessage mMachineキットを使用してmemGFP mRNAを転写。
- -801μg/μl、分注し、およびストアに得られたmRNAを希釈℃を
- 一つの細胞の段階で胚の幅は、レーンと1％アガロースの射出成形金型を準備します。
- 注射の前日に、女性から男性を分離交尾ケージを設定します。
- 注射の日に、注射の準備をマイクロピペットプラーを使用してキャピラリー針を引き抜きます。
2。 mRNAを注入
- 注射の日に、氷上に1μg/μlmemGFPのmRNAのアリコートを解凍。
- 200ng/μlの最終濃度に水でmRNAが1:5に希釈し、氷上に置きます。
- 200ng/μlで準備memGFPのmRNAの1μlのでキャピラリー針をロードする。
- ガソリンインジェクターに接続されているマイクロマニピュレータにロードされた針を置きます。
- 1nlに注入量を調整します。
- 前日から交配のケージに設定野生型の魚で仕切りを引っ張る。
- とすぐにそれらが配置されるように胚を収集する。オリエントそれら離れてマイクロマニピュレータの側の単一細胞で胚の培地（ウェスター、1995）でカバーアガロースの射出成形金型インチ
- 絨毛膜とmRNAは単一のセルに直接堆積されるように、卵黄を介して注入する。実験ごとに約50の胚を注入する。セルが分割されている場合に注入しないでください。
- 28℃で一晩胚の培地でインキュベートする胚
3。マウントおよびイメージング胚
- 胚をマウントし、イメージに、興味のある時点の前に実体顕微鏡一時間で胚から鉗子で絨毛膜を除去。
- 4胚まで取り付けるためのスライドを準備します。
- 直径約1cm穴を内蔵した特別設計の2ミリメートルの厚さのプラスチック製のスライドの下側にカバースリップを密封するために、シリコーン真空グリースを使用してください。
- 0.7％アガロースでスライドの穴を埋める、と約20分または硬化するまで放置
- アガロースが固化した後、それぞれの胚をマウントするに円筒状の穴を形成するために、200μlのピペットチップを使用して、小さなプラグを取り外します。
- 解剖顕微鏡下でアガロースを充填したスライド上に胚を置きます。胚を麻酔tricaine50μlの（ウェスター、1995）を追加します。
- 基本的なカバースリップに対する脳や関心領域とアガロースの円筒形の穴に胚を配置するために鉗子を使用してください。
- シリコン真空グリースで保護された別のカバースリップとアガロースの胚をカバーする。
- 反転、蛍光灯、レーザー走査型または回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて画像胚を。神経上皮内の単一セルの高解像度の画像を収集するために63x以上で画像。
- 画像は、LSMソフトウェアからのTIFFファイルとしてエクスポートし、Photoshopを使用して分析している。
4。代表的な結果/成果
図1に示すように、中脳と後脳の心室の間に24 HPFのゼブラフィッシュの神経上皮の代表的な共焦点画像です。各セルは、膜結合型GFPで標識されている。
図1。 memGFP注入24 HPFのゼブラフィッシュ胚の共焦点イメージングを生きる。
GFPによる概説、各セルで24 HPFの胚の（A）神経上皮。地域撮像さは中脳後脳境界を形成し、中脳と後脳の脳室（M、Hはそれぞれ）を分離。
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Discussion
このビデオでは、我々は単一細胞のゼブラフィッシュの胚へのmRNAの注入のための方法を示しています。ここでは、各セルにラベルを付けるために細胞膜をターゲットとしたGFPをコードするmRNAを使用してください。我々は、単一セルの分解能で脳の発達をマウントし、イメージする方法を示しています。このテクニックは、私たちは中脳後脳境界（Gutzmanら、2008）の形成に必要な細胞の形状変化、基底くびれ、新しいタイプを検討することができました。他の現象の同様の分析が大幅に脊椎動物の形態形成と基礎細胞生物学の我々の理解を拡大する可能性を秘めています。
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Acknowledgments
第一Siveラボでこのテクニックを開発した博士ジェニファーGutzmanに感謝します。親切にコードするプラスミドCAAX - GFPのmRNAを提供Dana - Farber癌研究所ボストン、マサチューセッツ州でもJBグリーンのおかげで。共焦点イメージングは、ホワイトヘッドでWMケック財団生体イメージング施設で行われた。 HSはNIHMH70926によってサポートされています。 EGは、NSFの事前博士フェローシップでサポートされています。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza Inc. | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR international | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | ||
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instrument Co. |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).
