Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

Summary

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Abstract

En este vídeo, se demuestra el método de nuestro laboratorio ha desarrollado para analizar los cambios en la forma celular y los reordenamientos requeridos para doblar y doblar el cerebro del pez cebra en desarrollo (Gutzman et al, 2008). Este tipo de análisis permite una nueva comprensión de la biología de las células subyacentes necesarios para el desarrollo de la estructura 3D del cerebro de los vertebrados, y aumenta de forma significativa nuestra capacidad de estudiar la morfogénesis del tubo neural. El cerebro tiene la forma de pez cebra embrionarias a partir de las 18 horas posteriores a la fecundación (HPF) en los ventrículos en el neuroepitelio inflar. Un 24 por HPF, los pasos iniciales de la morfogénesis del tubo neural se completa. Utilizando el método descrito aquí, los embriones en la etapa de una célula son inyectados con mRNA de membrana específicos de proteína verde fluorescente (memGFP). Después de la inyección y ahora de incubación, el embrión, entre 18 y 24 HPF, se monta, en posición invertida, en gel de agarosa y la imagen por microscopía confocal. En particular, el embrión de pez cebra es transparente por lo que es un sistema ideal para la proyección de imagen fluorescente. Si bien nuestro análisis se han centrado en el límite del cerebro medio-hindbrain y la parte posterior del cerebro, este método puede ser extendido para el análisis de cualquier región en el pez cebra a una profundidad de 80 a 100 micras.

Protocol

1. Preparación de los ARNm para inyección

1. El ARNm utilizados en este procedimiento se transcribe a partir de un plásmido que codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. En primer lugar linealizar el plásmido de acuerdo con Gutzman et al, 2008.
2. A continuación transcribimos ARNm memGFP con el mMessage mMachine kit.
3. Diluir el ARNm resultante de 1μg/μl, alícuota y almacenar a -80 ° C.
4. Preparar un molde de inyección de agarosa al 1% con los carriles de la anchura de los embriones en la etapa de la célula.
5. El día antes de la inyección, creado jaulas de apareamiento que separa el macho de las hembras.
6. En el día de la inyección, tire agujas capilar mediante un extractor de micropipeta para preparar la inyección.

2. La inyección del ARNm

1. En el día de la inyección, descongelar una alícuota de ARNm memGFP 1μg/μl en el hielo.
2. Diluir el ARNm de 1:5 en agua a una concentración final de 200ng/μl, y mantener en hielo.
3. La carga de la aguja capilar con 1μl de ARNm memGFP preparados en 200ng/μl.
4. Lugar cargado de aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector gas.
5. Ajustar el volumen de inyección de 1NL.
6. Tire de los separadores de la pesca de tipo salvaje establecido en las jaulas de apareamiento del día anterior.
7. Recoger los embriones tan pronto como se ponen. Orientarlos en el molde de inyección de agarosa cubierta por medio de embriones (Westerfield, 1995) con la única célula en el lado opuesto de la micromanipulador.
8. Inyectar a través del corion y la yema de tal manera que el ARNm es depositado directamente en la célula. Inyectar aproximadamente 50 embriones por experimento. No se inyecte, si la célula se ha dividido.
9. Embriones se incuban a 28 ° C durante la noche en medio de embriones

3. Montaje de imágenes y embriones

1. Para montar la imagen y los embriones, retire el corion con las pinzas de los embriones en un estereomicroscopio una hora antes del punto en el tiempo de interés.
2. Prepare una diapositiva para montar hasta cuatro embriones.
   • Utilice grasa de silicona para sellar al vacío un cubreobjetos en la parte inferior de una diapositiva de plástico especialmente diseñada 2mm de espesor con un agujero de aproximadamente 1 cm de diámetro.
   • Llenar el agujero en la diapositiva con el 0,7% de agarosa, y se deja reposar unos 20 minutos o hasta que se endurece
   • Una vez que la agarosa se ha solidificado, retirar un pequeño tapón con 200μl puntas de las pipetas para formar un agujero cilíndrico en el que se montará cada embrión.
3. Colocar los embriones en la diapositiva llena de agarosa con un microscopio de disección. Añadir 50μl de tricaína (Westerfield, 1995) para anestesiar a los embriones.
4. El uso de fórceps para colocar los embriones en los agujeros cilíndricos en la agarosa con el cerebro o la región de interés sobre el cubreobjetos subyacente.
5. Cubrir los embriones en la agarosa con otro portaobjetos asegurado con grasa de vacío de silicona.
6. Imagen del embrión utilizando un invertido, fluorescentes, de escaneo láser o girando microscopio confocal de disco. Imagen de 63x o superior para obtener imágenes de alta resolución de las células individuales dentro de la neuroepithelium.
7. Las imágenes se exportan como archivos TIFF del software LSM y se analizaron usando Photoshop.

4. Resultados representante / Resultados

Muestra en la Figura 1 es una imagen representativa confocal de un pez cebra neuroepitelio 24 HPF entre el cerebro medio y los ventrículos del cerebro posterior. Cada célula está marcada con GFP unido a la membrana.

Figura 1. Imagen confocal en vivo de una inyección de 24 memGFP embrión de pez cebra HPF.
(A) neuroepitelio de un embrión de 24 HPF con cada celda se indica por las buenas prácticas agrarias. Zona visualizada separa los ventrículos del cerebro medio y cerebro posterior (M, H, respectivamente), que forma el límite posterior del cerebro cerebro medio.

Discussion

En este vídeo, se demuestra un método para la inyección de ARNm en una sola célula de embriones de pez cebra. En este sentido, el uso de ARNm que codifica una membrana GFP dirigida a la etiqueta de cada célula. A continuación se muestra cómo montar y la imagen del cerebro en desarrollo con una resolución única célula. Esta técnica nos ha permitido estudiar un nuevo tipo de cambio en las células forma, constricción basal, necesario para la formación de la frontera del cerebro medio-hindbrain (Gutzman et al, 2008). Un análisis similar de otros fenómenos tiene el potencial para expandir significativamente nuestra comprensión de la morfogénesis de los vertebrados y la biología celular subyacente.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.