Summary
I denna video visar vi en metod för att analysera utvecklingen av ryggradsdjur hjärnan i levande zebrafisk embryon till en enda cell upplösning av konfokalmikroskopi. Detta inkluderar den metod som vi injicerar encelliga zebrafisk embryo och därefter montera och bild den växande hjärnan.
Abstract
I denna video visar vi metoden vårt laboratorium har utvecklats för att analysera de cellförändringar form och omflyttningar som krävs för att böja och vika utveckla zebrafisk hjärnan (Gutzman et al, 2008). En sådan analys ger en ny förståelse av de underliggande cellbiologi som krävs för utveckling av 3D-strukturen för ryggradsdjur hjärnan, och betydligt ökar vår förmåga att studera neuralrörsdefekter morfogenes. Den embryonala zebrafisk hjärnan är formad som börjar vid 18 timmar efter befruktning (HPF) som ventriklarna inom neuroepithelium blåsa. Genom 24 HPF, de första stegen i neuralrörsdefekter morfogenes är kompletta. Med hjälp av metoden som beskrivs här, är embryon till en cell scenen injiceras med mRNA kodning membran riktade grönt fluorescerande protein (memGFP). Efter injektion och inkubation, embryot, nu mellan 18 och 24 HPF, är monterad, inverterad, i agaros och avbildat av konfokalmikroskopi. Noterbart är zebrafisk embryot transparent vilket gör det till ett idealiskt system för lysrör avbildning. Medan våra analyser har fokuserat på mellanhjärnan-hindbrain gränsen och hindbrain, skulle denna metod förlängas för analys av en region i zebrafisk till ett djup av 80-100 ìm.
Protocol
1. Förbereda mRNA för injektion
- MRNA används i detta förfarande är transkriberas från en plasmid kodning CAAX-EGFP (memGFP) mRNA. Först linjärisera plasmiden enligt Gutzman et al, 2008.
- Sedan transkribera memGFP mRNA med mMessage mMachine kit.
- Späd den resulterande mRNA 1μg/μl, uppmätt, och förvara vid -80 ° C.
- Förbered en injektion mögel på 1% agaros med körfält bredden av embryon i en cell skede.
- Dagen före injektionen, inrätta parning burar separera hanen från honorna.
- På dagen för injektionen, dra kapillär nålar med hjälp av en mikropipett avdragare för att förbereda för injektion.
2. Injektion av mRNA
- På dagen för injektionen, tina en alikvot av 1μg/μl memGFP mRNA på is.
- Späd mRNA 1:05 i vatten till en slutlig koncentration av 200ng/μl, och hålla på is.
- Ladda kapillär nålen med 1μl preparerade memGFP mRNA vid 200ng/μl.
- Placera laddade nål i ett mikromanipulator ansluten till en gasdriven microinjector.
- Justera injektionsvolymen till 1nl.
- Dra avdelare på vilda typen fisk inrättades parning burar från föregående dag.
- Samla embryon så snart de läggs. Orientera dem i agarosen injektion mögel som omfattas av embryo medium (Westerfield, 1995) med en enda cell på sidan bort från mikromanipulator.
- Injicera genom chorion och äggulan så att mRNA sätts in direkt i en enda cell. Injicera ca 50 embryon per försök. Injicera inte om cellen har delat.
- Inkubera embryon vid 28 ° C över natten i embryot medelstora
3. Montering och Embryon Imaging
- Att montera och bild embryona, ta bort chorion med pincett från embryon under ett stereomikroskop en timme före tidpunkten av intresse.
- Förbered en bild för montering upp till 4 embryon.
- Använd fett silikon vakuum för att täta ett täckglas på undersidan av en specialdesignad 2mm tjock plast bild med ett hål med ca 1 cm i diameter.
- Fyll hålet i bilden med 0,7% agaros, och låt stå ca 20 minuter eller tills härdade
- När agarosen stelnat, ta bort en liten plugg med 200μl pipettspetsar att bilda cylindriska hål på sig att montera varje embryo.
- Placera embryon på agarosen fyllda glider under en dissekera mikroskop. Tillsätt 50μl av tricaine (Westerfield, 1995) att söva embryona.
- Använd pincett för att placera embryon i den cylindriska hål i agarosen med hjärnan eller regionen intresse mot den underliggande täckglas.
- Täck embryona i agaros med en annan täckglas säkrad med silikon vakuum fett.
- Bild ett embryo med ett inverterat, lysrör, laser-scanning eller spinning disk konfokalmikroskop. Bild på 63x eller högre för att samla in högupplösta bilder av enstaka celler i neuroepithelium.
- Bilderna exporteras som TIFF-filer från LSM programvara och analyserades med hjälp av Photoshop.
4. Representativa resultat / Utfall
Visas i figur 1 är en representant konfokala bild av en 24 HPF zebrafisk neuroepithelium mellan mellanhjärnan och ventriklarna hindbrain. Varje cell är märkt med membranbundna GFP.
Figur 1. Live konfokal avbildning av en memGFP-injicerade 24 HPF zebrafisk embryo.
(A) Neuroepithelium av en 24 HPF embryo med varje cell anges av GFP. Region avbildade separerar mitthjärnan och ventriklarna hindbrain (M, H respektive), bildar mellanhjärnan-hindbrain gränsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video visar vi en metod för mRNA injektion i enstaka embryon cell zebrafisk. Här använder vi mRNA som kodar för ett membran riktade GFP att etikettera varje cell. Vi visar sedan hur man monterar och bild den växande hjärnan på en enda cell upplösning. Denna teknik har gett oss möjlighet att studera en ny typ av celler formen förändring, basala sammandragning, som krävs för bildandet av mitthjärnan-hindbrain gränsen (Gutzman et al, 2008). Liknande analys av andra fenomen har potential att kraftigt öka vår förståelse av ryggradsdjur morfogenes och den underliggande cellbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ett stort tack till Dr Jennifer Gutzman som först utvecklade denna teknik i Sive labbet. Tack även till JB Green på Dana-Farber Cancer Institute i Boston, MA som välvilligt lämnat plasmiden kodning CAAX-GFP mRNA. Den konfokala bildhantering genomfördes på WM Keck stiftelsen biologisk avbildning Facility vid Whitehead. HS stöds av NIHMH70926. EG stöds av en NSF doktorander gemenskap.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza Inc. | 50027 | |
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
Silicone vacuum grease | Reagent | VWR international | W0S717 | |
Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
1-200 μl Pipette tips | Tool | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
Micromanipulator | Tool | Narishige International | ||
Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
Micropipette puller | Tool | Sutter Instrument Co. |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).