Summary
In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.
Abstract
In deze video, tonen we de methode ons lab heeft zich ontwikkeld tot de cel verandert de vorm en de herschikkingen nodig zijn om te buigen en vouwen de zich ontwikkelende hersenen zebravis (Gutzman et al., 2008) te analyseren. Een dergelijke analyse biedt een nieuw begrip van de onderliggende celbiologie die nodig zijn voor de ontwikkeling van de 3D-structuur van de gewervelde hersenen en verhoogt ons vermogen om neurale buis morfogenese bestuderen. De embryonale zebravis hersenen gevormd wordt vanaf 18 uur na de bevruchting (HPF) als de hartkamers binnen de neuroepithelium te blazen. Door 24 HPF, de eerste stappen van de neurale buis morfogenese zijn voltooid. Met behulp van de hier beschreven methode, worden embryo's aan de ene cel stadium geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor membraan-gerichte groen fluorescerend eiwit (memGFP). Na injectie en incubatie, het embryo, nu tussen 18 en 24 HPF, is gemonteerd, omgekeerd, in beeld gebracht door agarose en confocale microscopie. Met name de zebravis embryo is doorzichtig, waardoor het een ideaal systeem voor fluorescerende beeldvorming. Terwijl onze analyses hebben zich geconcentreerd op de middenhersenen-achterhersenen grens en de achterhersenen, zou deze methode worden uitgebreid voor de analyse van elke regio in de zebravis op een diepte van 80-100 micrometer.
Protocol
1. De voorbereiding van het mRNA voor injectie
- Het mRNA gebruikt in deze procedure is overgenomen uit een plasmide coderend voor CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. Eerst het plasmide lineariseren volgens Gutzman et al., 2008.
- Dan transcriberen memGFP mRNA met behulp van de mMessage mMachine kit.
- Verdun het resulterende mRNA naar 1μg/μl, aliquoot, en bewaar bij -80 ° C.
- Bereid een spuitgietmatrijs van 1% agarose met lanen de breedte van embryo's aan de ene cel podium.
- Op de dag vóór injectie, opgericht paring kooien het scheiden van de man uit de vrouwtjes.
- Op de dag van de injectie, trek capillaire naalden met behulp van een micropipet trekker voor te bereiden voor injectie.
2. Het injecteren van de mRNA
- Op de dag van de injectie, dooi een hoeveelheid van 1μg/μl memGFP mRNA op ijs.
- Verdun het mRNA 01:05 in water tot een uiteindelijke concentratie van 200ng/μl, en blijf op ijs.
- Laad de capillaire naald met 1μl geprepareerde memGFP mRNA op 200ng/μl.
- Plaats geladen naald in een micromanipulator aangesloten op een gas-aangedreven microinjector.
- Pas de injectie volume 1nl.
- Trek de scheidslijn op wild-type vis opgericht in paring kooien van de vorige dag.
- Het verzamelen van de embryo's zodra ze worden gelegd. Oriënteren ze in de agarose spuitgietmatrijs onder embryo medium (Westerfield, 1995) met de single cell aan de zijkant uit de buurt van de micromanipulator.
- Injecteren via het chorion en de dooier zodanig dat de mRNA direct wordt gestort in het enkele cel. Injecteer ongeveer 50 embryo's per experiment. Niet injecteren als de cel heeft gedeeld.
- Incubeer embryo's bij 28 ° C gedurende de nacht in embryo medium
3. Montage en Imaging embryo's
- Te monteren en het imago van de embryo's, verwijder de chorion met een tang uit de embryo's onder een stereomicroscoop een uur voor het tijdstip van belang.
- Bereiden op een glijbaan voor montage tot en met 4 embryo's.
- Gebruik siliconen vacuüm vet aan op een dekglaasje zegel op de onderkant van een speciaal ontworpen 2mm dikke plastic glijbaan met een gat van ongeveer 1 cm in diameter.
- Vul het gat in de dia met 0,7% agarose, en laat ongeveer 20 minuten of tot geharde
- Nadat de agarose is gestold en verwijderen van een kleine stekker gebruikt 200μl pipet tips om cilindrische gaten in welke vorm aan elk embryo te monteren.
- Plaats de embryo's op de agarose gevulde schuif onder een dissectie microscoop. Voeg 50μl van tricaïne (Westerfield, 1995) om de embryo's verdoven.
- Een tang om de embryo's positie in de cilindrische gaten in de agarose met de hersenen of de regio van belang tegen de onderliggende dekglaasje aan.
- Bedek de embryo's in de agarose met een andere dekglaasje vastgezet met siliconen vacuüm vet.
- Het imago van de embryo met behulp van een omgekeerde, TL-, laser-scanning of een draaiende schijf confocale microscoop. Beeld bij 63x of hoger nodig om hoge resolutie afbeeldingen van enkele cellen te verzamelen binnen de neuroepithelium.
- Afbeeldingen worden geëxporteerd als TIFF-bestanden van de LSM-software en geanalyseerd met behulp van Photoshop.
4. Vertegenwoordiger Resultaten / Resultaat
Weergegeven in figuur 1 is een representatief beeld van een confocale 24 HPF zebravis neuroepithelium tussen de middenhersenen en de achterhersenen ventrikels. Elke cel is voorzien van membraan-gebonden GFP.
Figuur 1. Live-confocale beeldvorming van een memGFP-injectie 24 hpf zebravis embryo.
(A) Neuroepithelium van een 24 HPF embryo met elke cel geschetst door GFP. Regio afgebeeld scheidt de middenhersenen en de achterhersenen ventrikels (M, H respectievelijk), de vorming van de middenhersenen-achterhersenen grens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video tonen we een methode voor het mRNA injectie in een cel zebravis embryo's. Hier maken we gebruik van mRNA dat codeert voor een membraan-gerichte GFP aan elke cel label. Vervolgens hebben we laten zien hoe te monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen van enkele cel resolutie. Deze techniek heeft ons toegelaten om een nieuw type van de cel van vorm veranderen, basale vernauwing, die nodig zijn voor de vorming van de middenhersenen-achterhersenen grens (Gutzman et al., 2008) te bestuderen. Soortgelijke analyse van andere verschijnselen heeft de potentie om flink uit te breiden ons begrip van gewervelde morfogenese en de onderliggende celbiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Veel dank aan Dr Jennifer Gutzman die als eerste deze techniek ontwikkeld in het Sive lab. Ook dank aan JB Green in het Dana-Farber Cancer Institute in Boston, MA, die zo vriendelijk op voorwaarde dat de plasmide coderend voor CAAX-GFP mRNA. De confocale imaging werd uitgevoerd op het WM Keck Foundation Biologische Imaging Facility bij de Whitehead. HS wordt ondersteund door NIHMH70926. EG wordt ondersteund door een NSF pre-doctorale beurs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza Inc. | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR international | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | ||
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instrument Co. |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).
