يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

Summary

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

Abstract

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح طريقة مختبرنا وقد وضعت لتحليل التغييرات وإعادة ترتيب شكل الخلية المطلوبة لثني والطي الدماغ الزرد النامية (Gutzman وآخرون ، 2008). مثل هذا التحليل يعطي فهما جديدا للبيولوجيا الخلية الأساسية اللازمة لتطوير البنية 3D الفقاريات من الدماغ ، ويزيد بشكل كبير من قدرتنا على دراسة التشكل أنبوب العصبي. يتشكل الدماغ الزرد الجنينية ابتداء من الساعة 18 التسميد آخر ساعة (HPF) والبطينين داخل الظهارة العصبية تضخيم. بنسبة 24 HPF ، والخطوات الأولية التشكل الأنبوب العصبي كاملة. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، يتم حقن الأجنة في مرحلة خلية واحدة مع ترميز الغشاء مرنا استهداف بروتين الفلورية الخضراء (memGFP). HPF بعد الحقن ، والحضانة ، وجنين ، وبين 18 و 24 الآن ، هي التي شنت ، مقلوب ، في agarose والتقط بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومن الجدير بالذكر أن الجنين الزرد شفافة مما يجعلها مثالية لنظام التصوير الفلورسنت. في حين ركزت تحليلاتنا على الحدود الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر والدماغ المؤخر ويمكن تمديد هذه طريقة لتحليل أي منطقة في الزرد إلى عمق 8-10 ميكرون.

Protocol

1. إعداد مرنا للحقن

1. وكتب على مرنا المستخدمة في هذا الإجراء من ترميز البلازميد CAAX - eGFP (memGFP) مرنا. يصبح خطي لأول مرة وفقا لبلازميد Gutzman آخرون ، 2008.
2. ثم نسخ مرنا memGFP باستخدام mMachine mMessage عدة.
3. تمييع مرنا مما أدى إلى 1μg/μl ، قسامة ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
4. إعداد قالب حقن agarose 1 ٪ مع الممرات عرض الأجنة في مرحلة خلية واحدة.
5. في اليوم قبل الحقن ، وإقامة أقفاص التزاوج فصل الذكور عن الإناث.
6. في يوم من الحقن ، وسحب الإبر الشعرية باستخدام مجتذب micropipette للتحضير للحقن.

2. حقن مرنا

1. في يوم من الحقن ، وأذاب an قسامة من مرنا memGFP 1μg/μl على الجليد.
2. تمييع 01:05 مرنا في الماء إلى التركيز النهائي لل200ng/μl ، والحفاظ على الجليد.
3. تحميل الإبرة الشعرية مع 1μl من مرنا memGFP أعدت في 200ng/μl.
4. مكان تحميل إبرة في micromanipulator تعلق على microinjector التي تعمل بالغاز.
5. ضبط مستوى الصوت لحقن 1nl.
6. سحب فواصل على الأسماك نوع البرية التي أنشئت في أقفاص التزاوج من اليوم السابق.
7. جمع الأجنة في أقرب وقت وضعت فيه. توجيهها في قالب حقن agarose تغطيها المتوسطة الجنين (Westerfield ، 1995) مع خلية واحدة على الجانب بعيدا عن micromanipulator.
8. من خلال ضخ المشيماء وصفار البيض بحيث يتم إيداع مرنا مباشرة في خلية واحدة. ضخ ما يقرب من 50 الأجنة في التجربة. لا حقن إذا كانت الخلية قد تنقسم.
9. احتضان الأجنة عند 28 درجة مئوية خلال الليل في وسط جنين

3. التركيب والتصوير الأجنة

1. لتحميل الصور والأجنة ، وإزالة المشيماء بالملقط من الأجنة في إطار ساعة واحدة قبل نقطة stereomicroscope الوقت للاهتمام.
2. إعداد شريحة متزايدة لتصل إلى 4 أجنة.
   • استخدام سيليكون الشحوم فراغ لابرام ساترة على الجانب السفلي من شريحة مصممة خصيصا 2mm وسميكة من البلاستيك مع وجود ثقب 1cm تقريبا في القطر.
   • سد ثقب في الشريحة مع agarose 0.7 ٪ ، واسمحوا الوقوف حوالي 20 دقيقة أو حتى تصلب
   • مرة واحدة وقد عززت agarose ، إزالة المكونات الصغيرة باستخدام ماصة 200μl نصائح لتشكيل الثقوب الأسطوانية التي لتحميل كل جنين.
3. وضع الأجنة على الشريحة agarose مليئة تشريح تحت المجهر. إضافة 50μl من tricaine (Westerfield ، 1995) لتخدير الأجنة.
4. استخدام ملقط لوضع الأجنة في ثقوب اسطوانية في agarose مع الدماغ أو المنطقة التي تهم ضد ساترة الكامنة.
5. تغطي الأجنة في agarose مع آخر ساترة المضمون مع الشحوم فراغ السيليكون.
6. صورة الجنين باستخدام مقلوب ، فلوري ، ليزر أو مسح القرص مبائر الغزل المجهر. الصورة في 63x أو أعلى لجمع صور عالية الدقة واحدة من الخلايا داخل الظهارة العصبية.
7. ويتم تصدير الصور على هيئة ملفات TIFF من برنامج LSM وتحليلها باستخدام برنامج فوتوشوب.

4. نتائج ممثل / نتائج

هو مبين في الشكل رقم 1 هو صورة من ممثل مبائر الظهارة العصبية 24 الزرد HPF بين الدماغ المتوسط ​​والبطينين الدماغ المؤخر. هو المسمى مع كل خلية غشاء محدد GFP.

الشكل 1. يعيش التصوير مبائر من memGFP حقن الجنين 24 الزرد HPF.
(A) الظهارة العصبية للجنين 24 HPF مع كل خلية التي حددها GFP. المنطقة تصوير الدماغ المتوسط ​​ويفصل بين البطينين الدماغ المؤخر (M ، H على التوالي) ، والتي تشكل الحدود الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر.

Discussion

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لحقن مرنا في واحد الأجنة الزرد الخلية. هنا ، فإننا نستخدم مرنا ترميز GFP غشاء استهداف لتسمية كل خلية. ثم نظهر كيفية تحميل وصورة الدماغ النامية في قرار خلية واحدة. وقد سمحت لنا هذه التقنية لدراسة نوع جديد من تغيير شكل الخلية ، وانقباض القاعدية ، المطلوبة لتشكيل الحدود الدماغ المتوسط ​​، الدماغ المؤخر (Gutzman وآخرون ، 2008). تحليل مماثل من الظواهر الأخرى لديها القدرة على التوسع بشكل كبير من فهمنا التشكل الفقاريات وبيولوجيا الخلايا الكامنة.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.