En direct l'imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

Abstract

Dans cette vidéo, nous démontrons la méthode de notre laboratoire a développé pour analyser les changements de forme des cellules et des réarrangements nécessaire pour courber et plier le cerveau de poisson zèbre en développement (Gutzman et al, 2008). Une telle analyse permet une nouvelle compréhension de la biologie cellulaire sous-jacentes nécessaires au développement de la structure 3D du cerveau des vertébrés, et augmente considérablement notre capacité d'étudier la morphogenèse du tube neural. Le cerveau de poisson zèbre embryonnaire est façonné à partir de 18 heures après fécondation (HPF) et les ventricules dans le neuroépithélium gonfler. Par 24 HPF, les étapes initiales de la morphogenèse du tube neural sont complets. En utilisant la méthode décrite ici, des embryons au stade une cellule sont injectés avec l'ARNm codant la membrane-cible la protéine fluorescente verte (memGFP). Après l'injection et l'incubation, l'embryon, maintenant entre 18 et 24 HPF, est monté sur le dos dans l'agarose et imagée par microscopie confocale. Notamment, l'embryon de poisson zèbre est transparent ce qui en fait un système idéal pour l'imagerie de fluorescence. Bien que nos analyses ont porté sur la frontière du mésencéphale-rhombencéphale et le rhombencéphale, cette méthode pourrait être étendue à l'analyse de toutes les régions du poisson-zèbre à une profondeur de 80-100 um.

Protocol

1. Préparation de l'ARNm pour injection

1. L'ARNm utilisés dans cette procédure est transcrit à partir d'un plasmide codant pour CAAX-EGFP (memGFP) ARNm. D'abord linéariser le plasmide selon Gutzman et al, 2008.
2. Puis de transcrire l'ARNm memGFP utilisant le kit mMessage mMachine.
3. Diluer l'ARNm résultant d'1μg/μl, aliquote, et conserver à -80 ° C.
4. Préparer un moule d'injection de 1% d'agarose avec des voies de la largeur d'embryons au stade une cellule.
5. Le jour avant l'injection, mis en place des cages d'accouplement qui sépare le mâle de la femelle.
6. Le jour de l'injection, tirez aiguilles capillaires aide d'un extracteur micropipette pour se préparer à l'injection.

2. L'injection de l'ARNm

1. Le jour de l'injection, le dégel d'une partie aliquote de l'ARNm memGFP 1μg/μl sur la glace.
2. Diluer l'ARNm 01h05 dans l'eau à une concentration finale de 200ng/μl, et de garder sur la glace.
3. Chargez l'aiguille capillaire avec 1 microlitre de l'ARNm memGFP préparé à 200ng/μl.
4. Placez chargés aiguille dans un micromanipulateur attaché à un microinjecteur alimentés au gaz.
5. Réglez le volume d'injection pour 1NL.
6. Tirez les diviseurs sur les poissons de type sauvage mis en place dans des cages d'accouplement de la journée précédente.
7. Recueillir les embryons dès qu'ils sont pondus. Orientez-les dans le moule d'injection d'agarose couverts par moyen d'embryons (Westerfield, 1995) avec la cellule unique sur le côté éloigné de la micromanipulateur.
8. Injecter dans le chorion et le jaune de telle sorte que l'ARNm est déposé directement dans la cellule unique. Injecter environ 50 embryons par expérience. Ne pas injecter si la cellule a divisé.
9. Embryons Incuber à 28 ° C pendant la nuit dans le milieu de l'embryon

3. Montage et embryons d'imagerie

1. Pour monter l'image et les embryons, supprimer le chorion avec une pince à partir des embryons sous un stéréomicroscope, une heure avant le point de temps d'intérêt.
2. Préparer une diapositive pour le montage jusqu'à 4 embryons.
   • Utilisez de la graisse à vide de silicone pour sceller une lamelle sur la partie inférieure d'une lame en plastique 2mm d'épaisseur spécialement conçu avec un trou d'environ 1cm de diamètre.
   • Remplissez le trou dans la diapositive avec 0,7% d'agarose, et laisser reposer environ 20 minutes ou jusqu'à durcis
   • Une fois que l'agarose solidifié, enlever un petit bouchon en utilisant 200 pl embouts de pipette pour former des trous cylindriques dans lesquels de monter chaque embryon.
3. Placer les embryons sur la lame d'agarose-remplie sous un microscope à dissection. Ajouter 50 pl de tricaïne (Westerfield, 1995) pour anesthésier les embryons.
4. Utilisez une pince pour la position de l'embryon dans les trous cylindriques dans l'agarose avec le cerveau ou la région d'intérêt contre la lamelle sous-jacent.
5. Couvrir les embryons dans l'agarose avec une autre lamelle sécurisé avec de la graisse à vide de silicone.
6. Image de l'embryon en utilisant une inversion, fluorescent, balayage laser ou la filature de microscope confocal à disque. Image à 63x ou plus pour recueillir des images haute résolution des cellules individuelles au sein du neuroépithélium.
7. Les images sont exportées sous forme de fichiers TIFF à partir du logiciel LSM et analysées à l'aide de Photoshop.

4. Résultats Représentant / résultat

Montre la figure 1 est une image représentative confocale d'un neuroépithélium 24 zebrafish HPF entre le mésencéphale et rhombencéphale ventricules. Chaque cellule est étiqueté avec membranaires GFP.

Figure 1. En direct d'imagerie confocale d'un memGFP-injecté 24 embryons de poissons zèbres HPF.
(A) d'un embryon neuroépithélium 24 HPF, chaque cellule étant définies par la GFP. Région imagé sépare le mésencéphale et rhombencéphale ventricules (M, H, respectivement), formant la limite du mésencéphale-rhombencéphale.

Discussion

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour l'injection d'ARNm dans les embryons de poissons zèbres seule cellule. Ici, nous utilisons ARNm codant pour la GFP membrane cible d'étiqueter chaque cellule. Nous avons ensuite montrer comment monter et l'image du cerveau en développement à la résolution seule cellule. Cette technique nous a permis d'étudier un nouveau type de cellules changent de forme, la constriction basale, nécessaire à la formation de la frontière du mésencéphale-rhombencéphale (Gutzman et al, 2008). Une analyse similaire des autres phénomènes a le potentiel d'augmenter considérablement notre compréhension de la morphogenèse des vertébrés et de la biologie cellulaire sous-jacent.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.