Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Summary

In questo video, si dimostra un metodo con cui analizzare il cervello dei vertebrati sviluppo in embrioni di zebrafish dal vivo a una risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Questo include il metodo con cui iniettare il unicellulare zebrafish e, successivamente, montare e immagine lo sviluppo del cervello.

Abstract

In questo video, dimostriamo il metodo nostro laboratorio ha sviluppato per analizzare i cambiamenti delle cellule forma e riarrangiamenti necessari per piegare e ripiegare il cervello pesce zebra di sviluppo (Gutzman et al, 2008). Tale analisi offre una nuova comprensione della biologia cellulare di base necessari per lo sviluppo della struttura 3D del cervello dei vertebrati, e aumenta notevolmente la nostra capacità di studiare la morfogenesi del tubo neurale. Il cervello ha la forma embrionale di zebrafish con inizio alle 18 ore dopo la fecondazione (HPF), come i ventricoli all'interno del neuroepitelio gonfiare. Da 24 HPF, i passi iniziali della morfogenesi del tubo neurale sono completi. Utilizzando il metodo descritto qui, gli embrioni allo stadio di una cellula sono iniettati con mRNA codifica membrana mirati proteina verde fluorescente (memGFP). Dopo l'iniezione e l'incubazione, l'embrione, ormai tra i 18 ei 24 HPF, è montato, capovolta, in agarosio e fotografato al microscopio confocale. In particolare, l'embrione di zebrafish è trasparente che lo rende un sistema ideale per l'imaging a fluorescenza. Mentre le nostre analisi si sono concentrate sul mesencefalo e il romboencefalo confine romboencefalo, questo metodo potrebbe essere esteso per l'analisi di qualsiasi altra regione del zebrafish ad una profondità di 80-100 micron.

Protocol

1. Preparazione del mRNA per iniezione

1. L'mRNA utilizzati in questa procedura è trascritto da un plasmide codifica CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. In primo luogo linearizzare il plasmide secondo Gutzman et al, 2008.
2. Poi trascrivere mRNA memGFP utilizzando il mMessage mMachine kit.
3. Diluire l'mRNA risultante 1μg/μl, aliquota, e conservare a -80 ° C.
4. Preparare uno stampo ad iniezione di 1% agarosio con corsie della larghezza di embrioni allo stadio di una cellula.
5. Il giorno prima dell'iniezione, istituito gabbie accoppiamento che separa il maschio dalla femmina.
6. Il giorno di iniezione, tirare aghi capillare con un estrattore micropipetta per preparare l'iniezione.

2. Iniezione del mRNA

1. Il giorno di iniezione, disgelo un'aliquota di mRNA memGFP 1μg/μl sul ghiaccio.
2. Diluire il mRNA 1:5 in acqua per una concentrazione finale di 200ng/μl, e tenere in ghiaccio.
3. Caricare l'ago capillare con 1ml di mRNA memGFP preparati a 200ng/μl.
4. Luogo carico ago in un micromanipolatore collegato a un alimentati a gas microinjector.
5. Regolare il volume di iniezione di 1nl.
6. Tirare i divisori di pesce di tipo selvatico in gabbia accoppiamento del giorno precedente.
7. Raccogliere gli embrioni non appena sono previste. Orientarle nello stampo ad iniezione agarosio coperto da media embrione (Westerfield, 1995) con la singola cella sul lato opposto del micromanipolatore.
8. Iniettare attraverso il corion e tuorlo in modo tale che l'mRNA viene depositato direttamente nella cella singola. Iniettare circa 50 embrioni per sperimentare. Non iniettare se la cella ha diviso.
9. Embrioni incubare a 28 ° C per una notte in media embrione

3. Montaggio e embrioni Imaging

1. Per montare l'immagine e gli embrioni, rimuovere il corion con una pinza da embrioni sotto uno stereomicroscopio un'ora prima del punto di tempo di interesse.
2. Preparare un vetrino per il montaggio fino a 4 embrioni.
   • Usare l'aspiratore grasso al silicone per sigillare un coprioggetto sulla parte inferiore di un apposito 2mm scivolo di plastica con un foro di circa 1 cm di diametro.
   • Riempire il buco nella diapositiva con il 0,7% di agarosio, e lasciate riposare circa 20 minuti o fino a quando indurito
   • Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere una piccola spina con 200μl puntali per formare fori cilindrici in cui montare ogni embrione.
3. Mettere gli embrioni in agarosio pieno vetrino sotto un microscopio da dissezione. Aggiungere 50μl di tricaine (Westerfield, 1995) per anestetizzare gli embrioni.
4. Usare pinze per posizionare gli embrioni nei fori cilindrici in agarosio con il cervello o la regione di interesse contro il coprioggetto sottostante.
5. Coprire gli embrioni in agarosio con un altro vetrino fissato con grasso al silicone vuoto.
6. Immagine l'embrione utilizzando un invertito, fluorescente, laser-scanning o spinning microscopio confocale disco. Immagine a 63x o superiore per raccogliere immagini ad alta risoluzione di singole cellule all'interno del neuroepitelio.
7. Le immagini vengono esportate come file TIFF dal software LSM e analizzati utilizzando Photoshop.

4. Risultati rappresentante / Esito

Mostrato nella Figura 1 è un'immagine rappresentativa confocale di un neuroepitelio 24 zebrafish hpf tra il mesencefalo e romboencefalo ventricoli. Ogni cella è etichettato con membrana GFP.

Figura 1. Vivere l'imaging confocale di un memGFP a iniezione 24 embrione zebrafish HPF.
(A) neuroepitelio di un embrione di 24 HPF con ogni cella delineato da GFP. Regione ripreso separa il mesencefalo e romboencefalo ventricoli (M, H rispettivamente), che formano il mesencefalo-rombencefalo confine.

Discussion

In questo video, si dimostra un metodo per iniezione di mRNA in embrioni di zebrafish singola cellula. Qui, usiamo mRNA codifica una membrana mirati GFP di etichettare ogni cella. Abbiamo poi dimostrare come montare e immagine lo sviluppo del cervello a risoluzione singola cellula. Questa tecnica ci ha permesso di studiare un nuovo tipo di cella di cambiare forma, costrizione basale, necessari per la formazione del mesencefalo-romboencefalo confine (Gutzman et al, 2008). Un'analisi simile di altri fenomeni ha il potenziale di espandere significativamente la nostra comprensione della morfogenesi dei vertebrati e la biologia delle cellule sottostanti.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.