공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

Summary

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

Abstract

이 비디오에서는, 우리는 우리의 실험실은 개발 zebrafish의 두뇌 (구츠맨 외, 2008)를 구부, 접이식하는 데 필요한 세포 모양 변경 및 rearrangements을 분석하기 위해 개발한 방법을 보여줍니다. 이러한 분석은 척추 두뇌의 3D 구조의 개발에 필요한 기본 세포 생물학의 새로운 이해를 내실수하고, 크게 신경 튜브 morphogenesis를 공부하는 능력을 증가시킵니다. 배아 zebrafish 두뇌는 neuroepithelium가 급증 내에 심실로 18시간 포스트 수정 (HPF)에서 시작 모양이다. 24 HPF으로 신경 튜브 morphogenesis의 초기 단계를 완료합니다. 방법을 사용하면 여기에 설명 한 세포 단계에서 배아는 mRNA 인코딩 막 타겟 녹색 형광 단백질 (memGFP)로 주입됩니다. 주입과 부화, 배아, 18 사이의 24 HPF 후, 아가로 오스에 거꾸로, 장착하고 공촛점 현미경으로 몇 군데. 특히, zebrafish 배아는 형광 이미징을위한 이상적인 시스템을 만들어 투명합니다. 우리의 분석은 midbrain - hindbrain 경계와 hindbrain에 초점을 가지고 있지만,이 방법은 80-100 μm의 깊이에 zebrafish에서 지역의 분석을 위해 연장 수 있습니다.

Protocol

1. 사출에 대한 mRNA 준비

1. 이 절차에 사용되는 mRNA는 플라스미드 인코딩 CAAX - eGFP (memGFP) mRNA에서 베꼈는데 있습니다. 먼저 플라스미드는 구츠맨 외, 2008에 따라 linearize.
2. 다음 mMessage mMachine 키트를 사용 memGFP mRNA를 고쳐 쓰다.
3. -80에서 결과 1μg/μl으로 mRNA, 나누어지는 및 상점을 희석 ° C.
4. 한 세포 단계에서 배아 차선의 넓이와 1퍼센트 아가로 오스의 사출 금형을 준비합니다.
5. 주사 전날에, 여성에서 남성을 분리 교배 새장을 설정합니다.
6. 주사 당일, 주사를 준비하는 micropipette의 풀러를 사용하여 모세 바늘을 가져옵니다.

2. mRNA를 주입

1. 주사 당일, 얼음 1μg/μl의 memGFP의 mRNA의 나누어지는를 녹여.
2. 200ng/μl의 최종 농도로 물에 mRNA 1:5 희석, 얼음 계속.
3. 200ng/μl에서 준비 memGFP의 mRNA의 1μl와 모세관 바늘을로드합니다.
4. 장소는 가스 공급 microinjector에 연결된 micromanipulator에 바늘을로드.
5. 1nl로 사출 볼륨을 조정합니다.
6. 전날부터 짝짓기 새장에 설치된 야생 종류의 물고기에 디바이더를 당겨.
7. 즉시 그들이 낳은 그대로 배아를 수집합니다. 동양들을 멀리 micromanipulator의 측면에 하나의 세포로 배아 매체 (웨스 터, 1995)이 적용 아가로 오스의 사출 금형 인치
8. chorion을 통해 삽입하여 mRNA가 하나의 세포에 직접 입금됩니다 그러한 노른자. 실험 당 약 50 배아를 주사. 세포가 나뉘어져있다면 삽입하지 마십시오.
9. 28 ° C 야간 배아 매체 품어 배아

3. 마운트 및 이미징 태아

1. 배아를 마운트 및 이미지하려면, 관심있는 시점 전에 stereomicroscope 일시간 아래의 배아에서 집게로 chorion를 제거합니다.
2. 4 배아까지 장착을위한 슬라이드를 준비합니다.
   • 직경이 약 1cm 구멍 특별히 고안된 2mm 두께의 플라스틱 슬라이드의 아래쪽에 coverslip을 봉인하기 위해 실리콘 진공 그리스를 사용합니다.
   • 0.7 % 아가로 오스와 슬라이드에 구멍을 채우기하고, 약 20 분 또는 강화된 때까지 대기하게
   • 아가로 오스가 확정되면, 각각의 배아를 탑재하는 원통형 구멍을 형성 200μl 피펫 팁을 사용하여 작은 플러그를 제거합니다.
3. 해부 현미경 아가로 오스 - 채워진 슬라이드에서 배아를 놓습니다. 배아를 마취하기 전에 tricaine의 50μl (웨스 터, 1995)를 추가합니다.
4. 기본 coverslip에 대한 뇌 또는 관심 영역으로 아가로 오스의 원통형 구멍에있는 배아를 위치 집게를 사용하십시오.
5. 실리콘 진공 그리스와 보안 다른 coverslip으로 아가로 오스의 배아를 커버.
6. 이미지를 사용하여 배아 거꾸로, 형광등, 레이저 - 스캔 또는 디스크 공촛점 현미경을 회전. 63x 또는 neuroepithelium 내에서 단일 세포의 고해상도 이미지를 수집하기 위해 높은에서 이미지.
7. 이미지는 LSM 소프트웨어에서 TIFF 파일 등 수출과 포토샵을 사용하여 분석하고 있습니다.

4. 대표 결과 / 결과

midbrain 및 hindbrain의 심실 사이에 24 HPF의 zebrafish의 neuroepithelium 대표 공촛점 이미지는 그림 1에 표시됩니다. 각 세포는 세포막 - 바운드 GFP와 함께 표시됩니다.

그림 1. memGFP - 주입 24 HPF의 zebrafish 배아의 공촛점 이미지를 살고 있습니다.
GFP에 의해 명시된 각 셀에있는 24 HPF의 배아의 (A) Neuroepithelium. 지역 몇 군데는 midbrain - hindbrain 경계를 형성, midbrain 및 hindbrain의 심실 (M, H 각각)을 분리합니다.

Discussion

이 비디오에서는, 우리는 단세포 zebrafish의 배아에 mRNA 분사하는 방법을 보여줍니다. 여기서는 각 셀에 레이블을 막 타겟 GFP를 인코딩 mRNA를 사용합니다. 그러면 단일 셀 해상도에서 개발 두뇌를 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 midbrain - hindbrain 경계의 형성 (구츠맨 외, 2008)에 필요한 세포 모양의 변화의 소설 유형, 기초 수축을 공부하고있었습니다. 다른 현상과 마찬가지로 분석을 크게 척추 morphogenesis 및 기본 세포 생물학에 대한 우리의 이해를 확장 가능성이있다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.