Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Summary

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Abstract

Neste vídeo, demonstramos o método de nosso laboratório tem desenvolvido para analisar as mudanças de células forma e rearranjos necessários para dobrar e dobrar o cérebro zebrafish em desenvolvimento (Gutzman et al, 2008). Essa análise permite uma nova compreensão da biologia das células subjacentes necessários para o desenvolvimento da estrutura 3D do cérebro de vertebrados, e aumenta significativamente a nossa capacidade de estudar a morfogênese do tubo neural. O cérebro zebrafish embrionárias é moldada a partir das 18 horas pós-fertilização (hpf) como os ventrículos dentro do neuroepitélio inflar. Por 24 hpf, os passos iniciais da morfogênese do tubo neural estão completos. Usando o método descrito aqui, embriões em fase de uma célula são injetados com a codificação do mRNA membrana-alvo a proteína verde fluorescente (memGFP). Após a injeção e de incubação, o embrião, agora entre 18 e 24 hpf, é montado, invertido, em agarose e visualizados por microscopia confocal. Nomeadamente, o embrião do zebrafish é transparente tornando-se um sistema ideal para imagens fluorescentes. Enquanto nossas análises se concentraram na fronteira mesencéfalo e rombencéfalo o rombencéfalo, este método pode ser estendido para a análise de qualquer região do peixe-zebra a uma profundidade de 8-10 mM.

Protocol

1. Preparando o mRNA para Injeção

1. O mRNA utilizado neste procedimento é transcrito a partir de um plasmídeo CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. Primeira linearizar o plasmídeo de acordo com Gutzman et al, 2008.
2. Em seguida, transcrever mRNA memGFP usando o mMessage mMachine kit.
3. Diluir o mRNA resultante para 1μg/μl, alíquota, e armazenar a -80 ° C.
4. Prepare um molde de injeção de agarose 1% com faixas da largura de embriões no estágio uma célula.
5. No dia antes da injeção, criada gaiolas de acasalamento separar o macho das fêmeas.
6. No dia da injeção, agulhas de puxar capilar utilizando um extrator micropipeta para se preparar para injeção.

2. Injetando o mRNA

1. No dia da injeção, descongelar uma alíquota de 1μg/μl mRNA memGFP no gelo.
2. Diluir o mRNA 1:5 em água a uma concentração final de 200ng/μl, e manter em gelo.
3. Carga a agulha capilar com 1μl de mRNA memGFP preparado em 200ng/μl.
4. Lugar carregado de agulha em um micromanipulador anexado a um microinjetor movidos a gás.
5. Ajustar o volume de injeção para 1nl.
6. Puxe os divisores de peixes do tipo selvagem criado em gaiolas de acasalamento do dia anterior.
7. Coletar os embriões logo que são colocados. Orientá-los no molde de injeção agarose coberta por meio de embrião (Westerfield, 1995) com a única célula do lado longe do micromanipulador.
8. Injetar através do córion e gema de tal forma que o mRNA é depositado diretamente em uma única célula. Injetar cerca de 50 embriões por experiência. Não injetar se a célula tem dividido.
9. Embriões incubar a 28 ° C durante a noite em meio embrião

3. Montagem e embriões de imagem

1. Para a montagem ea imagem dos embriões, remova o córion com uma pinça dos embriões sob um estereomicroscópio uma hora antes do ponto de tempo de interesse.
2. Prepare um slide para montagem de até quatro embriões.
   • Use graxa de vácuo silicone para selar uma lamela na parte inferior de uma lâmina de plástico especialmente concebidos dois milímetros de espessura, com um buraco de aproximadamente 1 centímetro de diâmetro.
   • Preencher o buraco no slide com agarose 0,7%, e deixe repousar cerca de 20 minutos ou até que endureceu
   • Uma vez que a agarose solidificou, remover uma pequena ficha usando 200μl ponteiras para formar buracos cilíndrico em que a montagem de cada embrião.
3. Coloque os embriões no slide cheio de agarose sob um microscópio de dissecação. Adicionar 50μl de tricaina (Westerfield, 1995) para anestesiar os embriões.
4. Use uma pinça para posicionar os embriões nos buracos cilíndricos no agarose com o cérebro ou região de interesse contra a lamela subjacente.
5. Cobrir os embriões no agarose com outra lamínula fixada com graxa de silicone a vácuo.
6. Imagem do embrião usando uma invertida, fluorescente, laser-scanning ou spinning microscópio confocal de disco. Imagem em 63x ou superior para coletar imagens de alta resolução de células individuais dentro do neuroepitélio.
7. As imagens são exportadas como arquivos TIFF a partir do software LSM e analisados ​​utilizando Photoshop.

4. Resultados representante / Resultado

Mostrado na Figura 1 é uma imagem representativa de um confocal neuroepitélio zebrafish 24 hpf entre o mesencéfalo e rombencéfalo ventrículos. Cada célula é marcada com GFP ligada à membrana.

Figura 1. Vivem de imagem confocal de um memGFP injetado embrião zebrafish 24 hpf.
(A) neuroepitélio de um embrião de 24 hpf com cada célula delineada pelo GFP. Região fotografada separa o mesencéfalo e rombencéfalo ventrículos (M, H, respectivamente), formando a fronteira mesencéfalo rombencéfalo.

Discussion

Neste vídeo, demonstramos um método para injeção de mRNA em embriões de peixe-zebra única célula. Aqui, usamos mRNA que codifica uma membrana GFP-alvo para rotular cada célula. Nós, então, demonstrar como montar e imagem do cérebro em desenvolvimento na resolução única célula. Esta técnica permitiu-nos a estudar um novo tipo de célula mudar de forma, a constrição basal, necessária para a formação da fronteira mesencéfalo rombencéfalo (Gutzman et al, 2008). Análise semelhante de outros fenômenos tem o potencial para expandir significativamente a nossa compreensão da morfogênese vertebrados e da biologia da célula subjacente.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
SeaKem GTG agarose	Reagent	Lonza Inc.	50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Capillary tubing	Tool	Frederick Haer and Co.	30-30-1	Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease	Reagent	VWR international	W0S717
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips	Tool	USA Scientific, Inc.	111-0806	These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit	Reagent	Ambion	AM1340	SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator	Tool	Narishige International
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI-100
Micropipette puller	Tool	Sutter Instrument Co.