Summary
GFP融合タンパク質は、広く共焦点顕微鏡による細胞小器官を可視化するために使用されます。しかし、細胞小器官の形態に影響を与える変異のスクリーニングは通常、個々の変異誘発を必要とし、時間のかかる作業です。ここで、我々は同時に、酵母のほぼ5000の非必須遺伝子のオルガネラ- GFPマーカーを組み込む方法を示しています。
Abstract
タンパク質の局在や細胞小器官の形態を調べるためにハイスループット法は、タンパク質相互作用を研究するための効果的なツールであり、分子経路の包括的な理解を達成するのに役立ちます。出芽酵母では、非必須遺伝子の欠失配列の発展とともに、我々は世界的に小胞体（ER）およびミトコンドリアを使用してGFP（または変異型）マーカー異なる遺伝子背景のようなさまざまな細胞小器官の形態を学ぶことができます。しかし、それぞれの単一変異に組み込んだGFPマーカーは、個別に労働集約的なプロセスです。ここで、我々は日常的に我々の研究室で使用されている手順を説明します。高密度の酵母アレイと薬剤選択のテクニックを処理するためのロボットシステムを使用することによって、我々は、大幅に必要な時間を短縮し、再現性を向上させることができます。簡単に言えば、我々はロボットレプリカ確保することにより、4672非必須遺伝子の欠失変異体の高密度配列にGFP -タグ付きミトコンドリアマーカー（Apc1 - GFP）を渡ります。二倍体の選択、胞子形成、発芽およびデュアルマーカーの選択を通じ、我々は両方の対立遺伝子を回復する。その結果、それぞれの半数体の単一変異体は、そのゲノム遺伝子座に組み込まApc1 - GFPが含まれています。今、我々はすべての非本質的な変異体バックグラウンドにおけるミトコンドリアの形態を学ぶことができます。このハイスループットアプローチを使用して、私たちは便利な研究とゲノム全体の設定の継承と細胞小器官の形成に関与する経路と遺伝子を描くことができる。
Protocol
材料および方法：
- 酵母菌株：
- Acp1 - GFP（GFP：：彼）：Acp1のC末端GFP -タグは、プラスミドpKT128を（GFPとHIS5を含む）を用いてPCRを介した相同組換えにより生成されました。陽性形質転換体は、共焦点顕微鏡とコロニーPCRにより確認した。ブーンラボ（トングとブーン、2006）から：歪みの背景には、BY7043（STE2pr - lue2lyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0：MATアルファcan1Δ）であった。
- 欠失変異体の配列（DMA）（XXX：：KanR）：それは、非必須遺伝子の約5,000の欠失変異体の配列です。これらの非必須遺伝子のすべては、G418にノックアウトされました。配列の歪みの背景には、BY4741（MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0）です。私たちのDMAは、もともとブーンラボからだ。
- DMAでAcp1 - GFPを組み込む：
GFPの配列を作るための以下のプロトコルは、修正を加えた合成遺伝子解析（SGA）技術（トンとブーン、2006）を改作したものです。レプリカピニングのすべての手順は、シンガーローター高密度アレイ化ロボットシステムを使用することによって行われます。また、マニュアルのピン配置または液体ベースの高密度アレイ化ロボットを使用することができます。
略語：YPD、酵母エキス - ペプトン - デキストロース、SD、合成ドロップアウト、LRK、ルー/アルギニン/リジンドロップアウトメディア、LHRK、ルー/彼/アルギニン/リジンドロップアウトメディア
準備- YPDプレートに一晩Acp1 - GFPの培養5 mlを注いでAcp1 - GFPの細胞の芝生を育てる。板は炎によって、または生物学的なドラフト内で十分に乾燥することができます。
- 30˚Cで一晩インキュベートする。
- プレート当たり1536コロニーにロボット、配列Acp1 - GFP株を使用した。同時に、レプリカはYPD + G418プレートに固定することによって、DMAの新しいコピーを準備する。
- 30˚Cで一晩培養する。
交配と二倍体の選択 - レプリカのピン配置やYPDプレート上のコロニーを上に敷設によるDMAとAcp1 - GFP株をかん。
- 30˚Cで一晩培養する。
- 二倍体細胞を（MATA / MATalpha）を選択するために彼の+ G418プレート - SD上にレプリカプレートコロニー。
- 30˚Cで一晩培養する。
Sporulationgと発芽 - 減数分裂胞子の形成を誘導する炭素源および窒素源の削減レベルを含む強化された胞子形成のメディア上にレプリカプレート二倍体コロニー、。
- 25˚C 5日間の最小のプレートをインキュベートする。
- LRKメディアにレプリカプレーティングしたコロニーでMATA減数分裂の子孫を発芽し、二日間、30˚Cで培養する。
- このメディアは、胞子からの半数体細胞の発芽を誘発する。 LUE2オープニングリーディングフレーム（ORF）はMATA -特異的STE2プロモーターに統合されているため、発芽すべての半数はMATAになります。
両方の対立遺伝子の選択 - それは今でGFPの対立遺伝子と、単一の変異型対立遺伝子の両方を選択する必要があります。これを達成するために、マタ細胞は、遺伝子の欠失（：：kanR XXX）を運ぶ半数体細胞のために選択LRK + G418メディア 、上にレプリカメッキされています。
- 30˚Cで一晩培養する。
- またAcp1 - GFPを（：：彼のGFP）保有：最後に、MATA減数分裂子孫は、単一の変異株の増殖を選択するためにLHRK + G418メディア （：kanR XXX）上にレプリカメッキです。これらのプレートは˚Cまでの3ヶ月間4℃保存することができます。
GFPの配列を作るための以下のプロトコルは、修正を加えた合成遺伝子解析（SGA）技術（トンとブーン、2006）を改作したものです。レプリカピニングのすべての手順は、シンガーローター高密度アレイ化ロボットシステムを使用することによって行われます。また、マニュアルのピン配置または液体ベースの高密度アレイ化ロボットを使用することができます。
略語：YPD、酵母エキス - ペプトン - デキストロース、SD、合成ドロップアウト、LRK、ルー/アルギニン/リジンドロップアウトメディア、LHRK、ルー/彼/アルギニン/リジンドロップアウトメディア
準備 - 顕微鏡：
- プレートから直接Acp1 - GFPを発現し、目的の変異体（s）を選ぶ。
- 30℃で細胞を成長° YPDまたはSDのC - 初期対数増殖期に彼のメディア。
- GFPのfiltersetを使用して共焦点顕微鏡により視覚化する。期待される結果の例は、図1に示します。
SGAメディア：
このプロトコルで使用されている増殖培地（YPD）と選択培地（SD）は、日常的に酵母分子生物学で使用されています。詳しい説明については、 酵母のメソッド （アンベルクら、2005）を参照してください。
LRK、LHRKメディア（400mlの合計）
| 順番に追加 | 量は |
| 硫酸アンモニウムと酵母窒素塩基 | 2.7グラム |
| アミノ酸ミックス | 0.8グラム |
| 寒天 | 8グラム |
| のdH 2 O | 360 mLの |
| オートクレーブ | |
| 20％ブドウ糖 | 40ミリリットル |
| 65˚Cに冷却 | |
| 100 mg / mLのカナバニン | 0.2ミリリットル |
| 100 mg / mLのthialysine | 0.2ミリリットル |
| プレート当たり50mlを注ぎ、混ぜる | |
LRK、LHRK + G418メディア（400mlの合計）
| 順番に追加 | 量は |
| 硫酸アンモニウムなし酵母窒素塩基 | 0.7グラム |
| アミノ酸ミックス | 0.8グラム |
| グルタミン酸1ナトリウム | 0.4 |
| 寒天 | 8グラム |
| のdH 2 O | 360 mLの |
| オートクレーブ | |
| 20％ブドウ糖 | 40ミリリットル |
| 65˚Cに冷却 | |
| 100 mg / mLのカナバニン | 0.2ミリリットル |
| 100 mg / mLのthialysine | 0.2ミリリットル |
| 200 mg / mlのG418 | 0.4ミリリットル |
| プレート当たり50mlを注ぎ、混ぜる | |
濃縮された胞子形成培地（400mlの合計）
| 順番に追加 | 量は |
| カリウム酢酸 | 4グラム |
| 酵母の抽出 | 0.4グラム |
| デキストロース | 0.2グラム |
| 胞子形成アミノ酸ミックス | 0.04グラム |
| 寒天 | 8グラム |
| のdH 2 O | 360 mLの |
| オートクレーブ | |
| 65˚Cに冷却 | |
| 200 mg / mlのG418 | 0.4ミリリットル |
| プレート当たり50mlを注ぎ、混ぜる | |
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Discussion
このメソッドは、様々な変異体背景にミトコンドリアマーカー、Acp1 - GFPを組み込む効率的に助けることができる。それは、ロボットシステムの使用に依存しており、簡単にロボットシステムで使用するために採用することができます。この手順は、マーカーの他のタイプを組み込むために使用することができます。例えば、ERを視覚化するために、我々は日常的にマーカーErg11 - GFPを使う。私たちの代表的な画像では、変異体とAcp1 - GFPのメーカーと野生型のミトコンドリアの形態を研究するために共焦点顕微鏡によりvisualiz EDでした。変異体は、中断ミトコンドリアの表現型を示したので、さらなる調査のための良い候補です。
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Acknowledgments
この作品は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究会議（助成金31/C15982）、保健研究、イノベーションのためのカナダ財団、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金、健康研究のためのマイケルスミス財団（助成金CJRへのカナダの協会によってサポートされていましたローウェン）、およびサイトのファイト。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
