Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

Summary

GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.

Abstract

Alto rendimento métodos para examinar localização de proteínas ou morfologia organela é uma ferramenta eficaz para o estudo de interações de proteínas e podem ajudar a alcançar uma compreensão abrangente de vias moleculares. Em Saccharomyces cerevisiae, com o desenvolvimento da matriz de exclusão não essenciais gene, podemos globalmente estudar a morfologia das organelas diferentes, como o retículo endoplasmático (ER) e da mitocôndria utilizando GFP (ou variante) marcadores no gene backgrounds diferentes. No entanto, os marcadores de GFP incorporando em cada mutante único individualmente é um processo trabalhoso. Aqui, descrevemos um procedimento que é utilizado rotineiramente em nosso laboratório. Usando um sistema robótico para lidar com arrays de alta densidade fermento e técnicas de seleção de drogas, podemos reduzir significativamente o tempo necessário e melhorar a reprodutibilidade. Em resumo, nós cruzamos um marcador GFP-tagged mitocondrial (Apc1-GFP) para um conjunto de alta densidade de 4.672 mutantes de deleção do gene não essencial por robótico réplica pinagem. Através da seleção diplóide, esporulação, germinação e seleção marcador dual, nós recuperamos ambos os alelos. Como resultado, cada mutante haplóide única contém Apc1 GFP-incorporados em seu locus genômica. Agora, podemos estudar a morfologia das mitocôndrias em todas fundo não essenciais mutante. Usando essa abordagem de alto rendimento, podemos convenientemente estudar e delinear os caminhos e os genes envolvidos na herança ea formação de organelas em um cenário de todo o genoma.

Protocol

Materiais e métodos:

1. Cepas de leveduras:
   • ACP1-GFP (GFP:: Seu): C-terminal GFP-tagging de ACP1 foi gerado por uma PCR mediada por recombinação homóloga usando pKT128 plasmídeo (contém GFP e HIS5). Transformantes positivos foram confirmados por microscopia confocal e colônia PCR. O pano de fundo a tensão foi BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratório (Tong e Boone, 2006).
   • Exclusão da Matriz Mutant (DMA) (xxx:: KanR): é um conjunto de cerca de 5.000 mutantes de deleção de genes não-essenciais. Todos estes genes não-essenciais foram eliminados na G418. O pano de fundo a tensão da matriz é BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Nosso DMA era originalmente de Boone laboratório.
2. Incorporando ACP1 GFP-no DMA:
   
   O seguinte protocolo para fazer uma série GFP é uma adaptação da Análise genético sintético (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) com modificações. Todas as etapas são feitas réplicas pinagem usando um ROTOR Cantor de alta densidade arraying sistema robótico. Alternativamente, manual pinagem ou um líquido baseado em robô arraying de alta densidade podem ser usados.
   
   Siglas: YPD, extrair-peptona-dextrose levedura; SD, sintéticos abandono; LRK, Lue / Arg / Lys abandono media; LHRK, Lue / His / Arg / Lys abandono media
   
   Preparação
   1. Crescer um gramado de ACP1-GFP células derramando um de 5 ml da cultura ACP1 GFP-noite em uma placa YPD. Permitem que o prato para secar suficientemente por uma chama ou um capuz biológica de fumos.
   2. Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite.
   3. Usando um robô array, ACP1 GFP-tensão em 1.536 colônias por placa. Ao mesmo tempo, preparar uma nova cópia da DMA pela réplica pinagem para placas YPD + G418.
   4. Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite.
      
      Acasalamento e seleção de diplóides
      
      
   5. Companheiro da estirpe ACP1 GFP com o DMA pela réplica pinagem e mais-que estabelece as colônias em placas YPD.
   6. Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite.
   7. Réplica da placa-colônias para SD - Seu placas G418 + para selecionar células diplóides (MATA / MATalpha).
   8. Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite.
      
      Sporulationg e germinação
      
      
   9. Réplica da placa-colônias diplóides em mídia esporulação melhorada, que contém níveis reduzidos de fontes de carbono e nitrogênio para induzir a formação de esporos meióticos.
   10. Incubar as placas a 25 ˚ C durante um mínimo de 5 dias.
   11. Germinar as progênies MATA meiótica por replica-plating as colônias em LRK media e incubar as placas a 30 ˚ C por dois dias.
   12. Esta mídia vai induzir a germinação das células haplóides a partir de esporos. Uma vez que um quadro de leitura LUE2 abertura (ORF) está integrado no promotor STE2 MATA-específica, todos os haplóides serão germinadas Mata.
       
       Seleção de ambos os alelos
       
       
   13. Agora é necessário selecionar ambos os alelos do GFP eo único alelo mutante. Para conseguir isso, as células Mata são réplicas banhados em LRK G418 + media, que seleciona para as células haplóides que carregam a deleção do gene (xxx:: kanR).
   14. Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite.
   15. Finalmente, as progênies MATA meiótica são réplicas banhados em LHRK G418 + media para selecionar para o crescimento de mutantes simples (xxx:: kanR) também abrigar ACP1-GFP (GFP:: His). Estas placas podem ser armazenadas a 4 ˚ C por até 3 meses.
   
   
   O seguinte protocolo para fazer uma série GFP é uma adaptação da Análise genético sintético (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) com modificações. Todas as etapas são feitas réplicas pinagem usando um ROTOR Cantor de alta densidade arraying sistema robótico. Alternativamente, manual pinagem ou um líquido baseado em robô arraying de alta densidade podem ser usados.
   
   Siglas: YPD, extrair-peptona-dextrose levedura; SD, sintéticos abandono; LRK, Lue / Arg / Lys abandono media; LHRK, Lue / His / Arg / Lys abandono media
   
   Preparação
3. Microscopia:
   1. Escolha o mutante desejado (s) expressando GFP-ACP1 diretamente do prato.
   2. Cultivar células a 30 ° C em YPD ou SD - Sua mídia a fase log cedo.
   3. Visualize por microscopia confocal usando o filterset GFP. Um exemplo de resultado esperado é mostrado na Figura 1.

SGA mídia:

A mídia de crescimento (YPD) e meios de comunicação selecionando (SD) utilizado neste protocolo é utilizado rotineiramente em biologia molecular de leveduras. Por favor, consulte Métodos de levedura (Amberg et al., 2005) para descrições detalhadas.

LRK, LHRK mídia (para 400 total de ml)

Adicionar a fim	Quantidade
Base de levedura nitrogenadas com sulfato de amônio	2,7 g
Aminoácidomistura	0,8 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 mL
Autoclave
Dextrose 20%	40 ml
Arrefecer a 65 ˚ C
100 mg / ml canavanina	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
Misture, despeje 50 ml por placa

LRK, LHRK G418 + media (para 400 total de ml)

Adicionar a fim	Quantidade
Base de levedura nitrogenados, sem sulfato de amônio	0,7 g
Mix de aminoácidos	0,8 g
O glutamato monossódico	0,4
Agar	8 g
dH 2 O	360 mL
Autoclave
Dextrose 20%	40 ml
Arrefecer a 65 ˚ C
100 mg / ml canavanina	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
200 mg / ml G418	0,4 ml
Misture, despeje 50 ml por placa

Enriquecido esporulação de mídia (para 400 total de ml)

Adicionar a fim	Quantidade
Acetato de potássio	4 g
Extrato de levedura	0,4 g
Dextrose	0,2 g
Esporulação mix de aminoácidos	0,04 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 mL
Autoclave
Arrefecer a 65 ˚ C
200 mg / ml G418	0,4 ml
Misture, despeje 50 ml por placa

Discussion

Este método pode ajudar eficientemente incorporar um marcador mitocondrial, ACP1-GFP em várias formações mutantes. Ele se baseia na utilização de um sistema robótico, e pode facilmente adotado para uso com qualquer sistema robótico. Este procedimento pode ser usado também para incorporar outros tipos de marcadores. Por exemplo, para visualizar ER, que utilizam rotineiramente o marcador Erg11-GFP. No nosso imagens representativas, uma mutante e um tipo selvagem com o fabricante ACP1-GFP foram visualiz ed por microscopia confocal para o estudo da morfologia mitocôndrias. O mutante mostrou perturbado fenótipo mitocondrial, e, portanto, um bom candidato para uma investigação mais aprofundada.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.