Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

Summary

De fusión GFP-proteínas son ampliamente utilizados para visualizar los orgánulos por microscopía confocal. Sin embargo, la detección de mutaciones que afectan a la morfología de los orgánulos por lo general requiere de mutagénesis individual y requiere mucho tiempo. En este caso, se demuestra un método para incorporar al mismo tiempo orgánulo-GFP marcadores en casi 5.000 genes no esenciales en la levadura.

Abstract

Métodos de alto rendimiento para examinar la localización de proteínas o la morfología orgánulo es una herramienta eficaz para el estudio de interacciones de proteínas y puede ayudar a lograr una comprensión integral de las vías moleculares. En Saccharomyces cerevisiae, con el desarrollo del conjunto de genes no esenciales la eliminación, que el mundo puede estudiar la morfología de los diferentes orgánulos como el retículo endoplasmático (ER) y las buenas prácticas agrarias con las mitocondrias (o variantes), los marcadores en los fondos genéticos diferentes. Sin embargo, la incorporación de los marcadores GFP en cada solo mutante individual es un proceso de trabajo intensivo. Aquí se describe un procedimiento que se utiliza habitualmente en nuestro laboratorio. Mediante el uso de un sistema robótico para manejar matrices de alta densidad de levadura y las técnicas de selección de medicamentos, se puede acortar significativamente el tiempo necesario y mejorar la reproducibilidad. En resumen, se cruza un marcador GFP-etiquetados mitocondrial (Apc1-GFP) en una matriz de alta densidad de 4.672 mutantes supresión de genes no esenciales de robótica depositadas réplica. A través de la selección diploide esporulación, la germinación y el marcador de selección dual, recuperamos los dos alelos. Como resultado, cada uno único mutante haploide contiene Apc1-GFP incorporado en su locus genómico. Ahora, podemos estudiar la morfología de las mitocondrias en todos los antecedentes mutante no esenciales. El uso de este enfoque de alto rendimiento, que convenientemente se puede estudiar y delimitar las vías y genes implicados en la herencia y la formación de orgánulos en un ambiente de todo el genoma.

Protocol

Material y métodos:

1. Cepas de levadura:
   • ACP1-GFP (GFP:: Su): C-terminal GFP-etiquetado de ACP1 fue generado por una PCR mediada por recombinación homóloga utilizando el plásmido pKT128 (contiene las buenas prácticas agrarias y HIS5). Transformantes positivos fueron confirmados por microscopía confocal y la colonia PCR. La cepa de antecedentes se BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratorio (Tong y Boone, 2006).
   • Eliminación de matriz mutante (DMA) (xxx:: KanR): es un conjunto de alrededor de 5.000 mutantes de deleción de genes no esenciales. Todos estos genes no esenciales fueron eliminados en la G418. La cepa de antecedentes de la matriz es BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Nuestra DMA fue originalmente de Boone laboratorio.
2. La incorporación de ACP1-GFP en la DMA:
   
   El siguiente protocolo para la toma de una amplia GFP es una adaptación del análisis genético sintético (SGA) tecnología (Tong y Boone, 2006) con modificaciones. Todos los pasos están depositadas réplica hecha usando un ROTOR Cantante de alta densidad arraying sistema robótico. Por otra parte, manual o fijando una base líquida de alta densidad de robots arraying puede ser utilizado.
   
   Siglas: YPD, extracto de levadura peptona-dextrosa, SD, el abandono de síntesis; LRK, Lue / Arg / Lys deserción medios de comunicación; LHRK, Lue / Su / Arg / Lys medios de deserción escolar
   
   Preparación
   1. Crecer el césped de ACP1-GFP células mediante el vertido de un 5 ml de la noche ACP1-GFP cultura sobre una placa de YPD. Permitir que la placa se seque lo suficiente por una llama o en una campana de extracción biológica.
   2. Incubar la placa a 30 ˚ C durante la noche.
   3. El uso de un robot, matriz ACP1-GFP cepa en 1536 colonias por placa. Al mismo tiempo, preparar una nueva copia de la DMA por réplica depositadas en placas YPD + G418.
   4. Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche.
      
      El apareamiento y la selección diploide
      
      
   5. Compañero de la cepa ACP1-GFP con la DMA por réplica de fijación y colocación de más de las colonias en las placas de YPD.
   6. Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche.
   7. Placa de réplica, las colonias en SD - Su + placas G418 para seleccionar las células diploides (MATA / MATalpha).
   8. Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche.
      
      Sporulationg y la germinación
      
      
   9. Placa de réplica, las colonias diploides en los medios de comunicación una mayor esporulación, el cual contiene los niveles de reducción de fuentes de carbono y nitrógeno para inducir la formación de esporas meióticas.
   10. Las placas se incuban a 25 ˚ C durante un mínimo de 5 días.
   11. Germinan las progenies MATa meiótica de las colonias en placas replica-LRK los medios de comunicación e incubar las placas a 30 ˚ C durante dos días.
   12. Este medio se induce la germinación de las células haploides a partir de esporas. Desde un marco de apertura de la lectura LUE2 (ORF) se integra en el promotor MATa específicos STE2, todos los haploides germinado se MATA.
       
       Selección de los dos alelos
       
       
   13. Ahora es necesario seleccionar tanto el alelo GFP y el alelo mutante único. Para lograr esto, las células de Mata son réplica chapada en los medios de comunicación LRK + G418, que selecciona las células haploides que llevan el gen de supresión (xxx:: KanR).
   14. Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche.
   15. Por último, las progenies MATa meiótica son réplica chapada en LHRK medios G418 + para seleccionar el crecimiento de los mutantes individuales (xxx:: KanR) también alberga ACP1-GFP (GFP:: Su). Estas placas pueden ser almacenadas a 4 ˚ C durante un máximo de 3 meses.
   
   
   El siguiente protocolo para la toma de una amplia GFP es una adaptación del análisis genético sintético (SGA) tecnología (Tong y Boone, 2006) con modificaciones. Todos los pasos están depositadas réplica hecha usando un ROTOR Cantante de alta densidad arraying sistema robótico. Por otra parte, manual o fijando una base líquida de alta densidad de robots arraying puede ser utilizado.
   
   Siglas: YPD, extracto de levadura peptona-dextrosa, SD, el abandono de síntesis; LRK, Lue / Arg / Lys deserción medios de comunicación; LHRK, Lue / Su / Arg / Lys medios de deserción escolar
   
   Preparación
3. Microscopía:
   1. Elija el que desee mutante (s) que expresa ACP1-GFP directamente desde la placa.
   2. Se cultivan las células a 30 ° C en YPD o SD - Sus medios de comunicación para la fase de registro inicial.
   3. Visualizar por microscopía confocal utilizando el filterset GFP. Un ejemplo del resultado esperado se muestra en la Figura 1.

SGA medios de comunicación:

Los medios de cultivo (YPD) y los medios de selección (SD) que se utiliza en este protocolo se utiliza habitualmente en biología molecular de levaduras. Por favor refiérase a los métodos de la levadura (Amberg et al., 2005) para mayor información.

LRK, LHRK los medios de comunicación (para un total de 400 ml)

Añadir el fin	Cantidad
Base nitrogenada de levadura con sulfato de amonio	2,7 g
Aminoácidomezcla	0,8 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
20% de dextrosa	40 ml
Enfriar a 65 ˚ C
100 mg / ml canavanina	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
Mezclar, verter 50 ml por placa

LRK, LHRK + G418 medios de comunicación (para un total de 400 ml)

Añadir el fin	Cantidad
Base nitrogenada de levadura sin sulfato de amonio	0,7 g
Mezcla de aminoácidos	0,8 g
Glutamato monosódico	0.4
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
20% de dextrosa	40 ml
Enfriar a 65 ˚ C
100 mg / ml canavanina	0,2 ml
100 mg / ml thialysine	0,2 ml
200 mg / ml G418	0,4 ml
Mezclar, verter 50 ml por placa

Enriquecido esporulación los medios de comunicación (para el total de 400 ml)

Añadir el fin	Cantidad
Acetato de potasio	4 g
Extracto de levadura	0,4 g
Dextrosa	0,2 g
Esporulación mezcla de aminoácidos	0,04 g
Agar	8 g
dH 2 O	360 ml
Autoclave
Enfriar a 65 ˚ C
200 mg / ml G418	0,4 ml
Mezclar, verter 50 ml por placa

Discussion

Este método puede ayudar a incorporar de manera eficiente un marcador mitocondrial, ACP1-GFP en varios mutantes antecedentes. Se basa en el uso de un sistema robótico, y fácilmente se puede adoptar para su uso con cualquier sistema robótico. Este procedimiento puede ser utilizado también para la incorporación de otros tipos de marcadores. Por ejemplo, para visualizar la sala de emergencia, nosotros usamos el marcador Erg11-GFP. En nuestras imágenes representativas, un mutante y un tipo salvaje con el fabricante de ACP1-GFP se visualiz ed por microscopía confocal para estudiar la morfología de las mitocondrias. Los mutantes mostraron fenotipo mitocondrial interrumpida, y por lo tanto un buen candidato para una mayor investigación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.