Summary
Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.
Abstract
Todo el montaje
Protocol
1. FIJACIÓN
- Fix embriones noche a 4 ° C con 4% paraformaldehído (PFA) en PBS.
- Quitar arreglar y lavar 2 x PBS, 5 minutos cada uno, a temperatura ambiente (RT).
- Embriones manualmente dechorionate en PBS en una placa de vidrio depresión usando pinzas de relojero. Después de dechorionation, los embriones se transfieren por medio de un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio, ya que puede adherirse a las pipetas de polipropileno.
- La transferencia de embriones a través de una serie de 25%, 50% y 75% de metanol en PBS durante 5 minutos cada uno.
- Sustituir el líquido con metanol al 100%, incubar 5 minutos y luego vuelva a colocar con metanol nuevo.
- Embriones lugar a -20 ° C durante un mínimo de una hora. (Por lo general los embriones se incuban durante la noche. Estándar de hibridación in situ trabajará con embriones almacenados durante más de un año, pero que no han examinado si la alta resolución de la hibridación fluorescente in situ se pierde por un almacenamiento prolongado.)
- Lavado de embriones de 5 minutos cada uno en el 75%, 50%, 25% de metanol en PBST a temperatura ambiente. Lavar dos veces durante 5 minutos cada uno en PBST a temperatura ambiente.
- Fijar de nuevo durante 20 minutos en PFA al 4% en PBS a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces durante 5 minutos cada uno en PBST a temperatura ambiente.
NOTA CON RESPECTO A PFA:
Nosotros guardamos la PFA al 4% en alícuotas a -20 º C (ver tabla de reactivos). Para la fijación inicial, sólo usamos PFA que no haya sido previamente descongelado. Para las fijaciones posteriores, a menudo utilizamos PFA que ha sido previamente descongelado. La fijación inicial parece ser crítica para la tinción de éxito con este protocolo.
2. Proteinasas y postfijación
- Digerir con proteinasa K (5μg/ml en PBST) a temperatura ambiente durante 3 a 12 minutos para permeabilizar los embriones. (El tiempo de incubación depende de la edad de los embriones más jóvenes las etapas son más sensibles. También depende de los lotes de la enzima.) Para los embriones etapa somitogenesis, por lo general permeabilizar durante 3-4 minutos. Durante la incubación, ponemos el tubo de microcentrífuga de su lado.
- Enjuague brevemente en PBST y lavar una vez por 5 minutos en PBST.
- Fijar de nuevo durante 20 minutos en PFA al 4% en PBS a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces, durante 5 minutos cada uno, en PBST a temperatura ambiente.
3. Prehibridación
- Incubar los embriones durante 5 minutos a 65 º C en HYB.
- Prehybridize a 65 º C durante al menos 1 hora en HYB +.
4. HIBRIDACIÓN
- Eliminar todos menos 50 l de la preHYB, pero asegúrese de mantener los embriones completamente sumergido.
- Agregue 1-2 l de cada riboprobe (digoxigenina y fluoresceína riboprobes) de los embriones y mezclar agitando suavemente el tubo. La cantidad de sonda suele ser de 1 2μl de una reacción de síntesis de la sonda 20μl.
- Dado que la fluoresceína es sensible a la luz, los tubos deben ser envueltos en papel de aluminio o de lo contrario expone a la luz mínima a partir de ahora.
- Incubar los embriones durante la noche a 65 º C.
5. SONDA DE RETIRO
Tenga en cuenta que las soluciones a partir de este punto de la falta de detergente adelante. Eliminación de detergente parece ayudar a las reacciones de tinción, pero hace que el embrión para convertirse en algo pegajoso.
- Retire la riboprobe.
- Lavado de 2 x 30 minutos a 65 º C en el 50% formamide/2xSSC.
- Lávese las manos por 15 minutos a 65 º C en 2 x SSC.
- Lavar por 30 minutos a 65 º C en 0,2 x SSC.
6. Anti-fluoresceína ANTICUERPOS INCUBACIÓN
- Bloque de al menos 1 hora a temperatura ambiente en 500μl de una solución de 1x tampón ácido maleico más reactivo 2% de bloqueo (véase la tabla de los reactivos).
- Añadir el anticuerpo anti-fluoresceína-POD, suministrado por Roche, en una dilución de 1:500 en la solución de bloqueo.
- Incubar toda la noche a 4 º C. Durante la incubación, ponemos el tubo de microcentrífuga de su lado.
- Lavar 4 x 20 minutos en tampón 1x ácido maleico. Lavar dos veces durante 5 minutos cada uno en PBS.
7. DETECCIÓN DE fluoresceína ETIQUETA DE SONDA
- Incubar 30-60 minutos en TSA más una solución de fluoresceína. (Decantar sustrato TSA antes de tomar la solución de tinción. Para la reacción, se diluye el reactivo tyramide 1:50 en Perkin Elmer diluyente tampón de amplificación.) Durante esta incubación, colocar el tubo de microcentrífuga de su lado. El tiempo de reacción debe ser determinada empíricamente para cada sonda. Por desgracia, la reacción de tinción no se puede controlar visualmente que el sustrato es fluorescente, y se verá fluorescencia verde en todas partes a lo largo de la reacción de tinción.
- Lávese las manos por 10 minutos cada uno en el 30%, 50%, 75% y 100% de metanol en PBS.
- Se incuban en una solución de 1% de H 2 0 2 en metanol durante 30 minutos para inactivar la peroxidasa en primer lugar.
- Lavado de 10 minutos cada uno en el 75%, 50% y 30% de metanol en PBS. A continuación, lavar dos veces durante 10 minutos cada uno en PBS. Es importante que todos se reunieronhanol ser eliminado.
NOTAS SOBRE EL amplificación de la señal tiramida:
Hemos estado utilizando los kits de Perkin Elmer TSA. Nos encontramos con que los sustratos Alexa-tiramida tiñen bien con el Perkin Elmer amplificación buffer diluyente, pero no hemos tenido éxito en el uso de la tinción de amortiguación siempre con los kits de sondas Invitrogen / Molecular. Por último, hemos encontrado que Cy5 fluorescencia se elimina por posteriores metanol / H 2 O 2, mientras que el tratamiento con fluoresceína y Alexa 647-no se ven afectadas. Cy3 también puede verse afectado negativamente por el metanol / H 2 O 2 tratamiento, ya que está relacionada estructuralmente con Cy5. Por esta razón, Cy3 y Cy5 reacciones TSA sólo debe ser utilizado para la reacción de tinción segundo de una doble fluorescente in situ protocolo.
8. ANTICUERPOS ANTI-digoxigenina INCUBACIÓN
- Bloquear los embriones de nuevo por lo menos 1 hora a temperatura ambiente en una solución de 1x tampón ácido maleico más el 2% reactivo de bloqueo.
- Añadir el anticuerpo anti-DIG POD suministrado por Roche en una dilución 1:1000 en solución de bloqueo por encima de
- Incubar toda la noche a 4 º C. Durante la incubación, ponemos el tubo de microcentrífuga de su lado.
- Lavar 4 x 20 minutos en tampón 1x ácido maleico. Lavar dos veces durante 5 minutos cada uno en PBS.
9. DETECCIÓN DE digoxigenina-ETIQUETA DE SONDA
- Incubar 30-60 minutos en TSA Además Cy5 solución (Decantar sustrato TSA antes de tomar la solución de tinción. Para la reacción, se diluye el reactivo tyramide 1:50 en tampón de amplificación diluyente) Durante esta incubación, colocar el tubo de microcentrífuga de su lado. El tiempo de reacción debe ser determinada empíricamente para cada sonda.
- Lavar tres veces durante 10 minutos cada uno en PBST.
10. Tinción con yoduro de propidio
- Lavar dos veces durante 5 minutos cada uno en 2 x SSC.
- Incubar los embriones durante 30 minutos a 37 ° C en 50 l SSCT 2 x con 10 l de RNasa (para una concentración final de 100μg/ml).
- Lávese las seis veces durante 3 minutos cada uno en 2 x SSC a temperatura ambiente.
- Tinción de embriones durante 8 minutos en una solución de yoduro de propidio 330μg/ml en 2 x SSC.
- Lávese las seis veces durante 3 minutos cada uno en 2 x SSC a temperatura ambiente.
- Fijar durante 20 minutos en PFA al 4% en PBS a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces, durante 5 minutos cada uno, en PBST a temperatura ambiente.
11. MONTAJE
- Incubar los embriones durante 10 minutos cada uno en el 25% y 50% de glicerol en PBST. Borrar toda la noche en el 75% de glicerol a 4 º C.
- Nos diseccionar y deyolk los embriones y plano que se montan en un portaobjetos de microscopio. La yema puede producir fluorescencia de fondo importantes. La disección es mucho más fácil después de que los embriones hayan desaparecido ovenight en gylcerol.
SOLUCIONES:
| PBST | PBS más 0,1% de Tween | |
| SSCT | SSC más el 0,1% de Tween | |
| HYB- | Formamida al 50% 5xSSC 0,1% de Tween-20 | |
| HYB + | HYB- 5mg/ml torula (levadura) de ARN 50μg/ml heparina | El ARN torula es preparado por digestión con proteinasa K de ARN, con la consiguiente fenol, fenol-cloroformo y cloroformo-extraction.The ARN se precipita y se disuelven en agua tratada con DEPC. |
| 1 x tampón ácido maleico | 150 mM de ácido maleico, 100 mM NaCl (pH 7,5) |
Figura 1. Los resultados representativos del monte se doble hibridación in situ fluorescente. (AC). Las imágenes muestran una sola sección confocal a través de la región posterior de un embrión de pez cebra en la etapa de diez somite. La vista es dorsal anterior a la cima. Núcleos teñidos con yoduro de propidio son de color azul. (A) mRNA deltaC se detectó mediante un riboprobe digoxigenina marcado y el reactivo de TSA-Cy5. (B) ARNm transcrito a partir del gen HER1 se detectó con un riboprobe marcado con fluoresceína y reactivo TSA-fluoresceína. (C) La fusión de los canales verde y rojo identifica de forma inequívoca las regiones de la expresión de genes distintos o superposición de los dos genes. (D, E) Detalle de HER1 expresión que demuestra la alta resolución de este procedimiento. Localización subcelular de ARNm se puede discernir con claridad. Puntas de flecha indican una célula exhibe transcripción activa, revelada por los puntos de la tinción en el núcleo. Las flechas indican la celda que muestra la localización citoplasmática del ARNm. (F, G) Doble tinción de HER1 y deltaC revela que las células son la transcripción de los genes (punta de flecha blanca), o cualquiera de los genes por separado (puntas de flecha de color rojo y verde).
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Discussion
El protocolo presentado aquí funciona bien con las sondas que dar una señal fuerte limpia después de la tinción de 30-45 minutos en una fosfatasa alcalina típica mediada por la reacción. Antes de realizar la fluorescencia en el protocolo de hibridación in situ, siempre prueba de nuestras sondas utilizando el estándar de protocolo no fluorescente (siempre en el material complementario junto con el protocolo de síntesis de la sonda). Hemos tenido menos éxito con los fluorescentes en el protocolo de hibridación in situ utilizando sondas más débil, pero puede ser posible en algunos casos. Hemos combinado con éxito las fluorescentes en el protocolo de hibridación in situ con la inmunolocalización de β-catenina 3. Al realizar esta variación, nosotros hacemos el HYB, HYB + y incubaciones hibridación a 55 ° C en lugar de 65 ° C como los epítopos parece ser mejor conservados a la temperatura más baja. Las incubaciones inmunolocalización se realizan después de las reacciones de la TSA.
Desde marcado con fluoresceína sondas son generalmente más débiles que una sonda marcada con digoxigenina-para el mismo gen, por lo general visualizar la sonda marcada con fluoresceína en primer lugar. Un caso donde uno puede querer visualizar la sonda digoxygenin primera es que si uno de los dos genes se expresa en un nivel bajo. En este caso, se hace un digoxigenina-riboprobe para el gen de la debilidad y las manchas de primero a maximizar la relación señal-ruido. Tenga en cuenta que si usted visualiza la segunda sonda de fluoresceína, no se debe visualizar la sonda digoxygenin con fluoresceína TSA como el anticuerpo anti-fluoresceína reconocerá la TSA mancha, así como la riboprobe marcado con fluoresceína.
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Acknowledgments
Nos gustaría agradecer las contribuciones de Dörthe Jülich, Ronda de Jennifer y Andrew Mara en el desarrollo de este protocolo. Apoyo a la investigación proporcionada por el NICHD, la Sociedad Americana del Cáncer y la Fundación March of Dimes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
