Summary
स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों का है. यहाँ, हम एक डबल एक जीन की सटीक अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए और दो जीन की अभिव्यक्ति डोमेन के ओवरलैप का निर्धारण करने के लिए स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में फ्लोरोसेंट उच्च संकल्प प्रस्तुत करते हैं. हम एक परमाणु propidium आयोडाइड ऊतक संगठन पर प्रकाश डाला काउंटर दाग शामिल हैं.
Abstract
पूरे माउंट
Protocol
1. निर्धारण
- 4 में रातोंरात भ्रूण डिग्री सेल्सियस पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ ठीक
- ठीक निकालें और कमरे के तापमान (आर टी) पर 2 x Pbs, 5 मिनट प्रत्येक धोने.
- पीबीएस में एक गिलास अवसाद घड़ीसाज़ संदंश का उपयोग कर प्लेट में मैन्युअल dechorionate भ्रूण. Dechorionation के बाद, भ्रूण एक आग पॉलिश कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं के रूप में वे polypropylene pipettes के लिए छड़ी कर सकते हैं.
- 25% की एक श्रृंखला है, 50% और 5 मिनट के लिए पीबीएस में 75% मेथनॉल के माध्यम से भ्रूण स्थानांतरण.
- 100% मेथनॉल के साथ तरल बदलें, 5 मिनट सेते और फिर ताजा मेथनॉल के साथ की जगह.
- एक घंटे की एक न्यूनतम के लिए प्लेस -20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण. (आम तौर पर हम भ्रूण रातोंरात सेते स्वस्थानी संकरण में मानक एक वर्ष से अधिक के लिए संग्रहीत भ्रूण पर काम करेंगे, लेकिन हम नहीं की जांच की है चाहे स्वस्थानी संकरण में फ्लोरोसेंट के उच्च संकल्प लंबे समय तक भंडारण के द्वारा खो दिया है.)
- 75% में 5 मिनट, 50%, आरटी PBST में 25% मेथनॉल के लिए भ्रूण धो लें. आरटी PBST में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोएं.
- 4% आरटी में पीबीएस में पीएफए में 20 मिनट के लिए फिर से ठीक है.
- आरटी PBST में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोएं.
पीएफए के संबंध में नोट:
हम -20 º सी aliquots में 4% पीएफए की दुकान (अभिकर्मकों की तालिका देखें). प्रारंभिक निर्धारण के लिए, हम केवल पीएफए उपयोग है कि पहले कभी नहीं thawed है. बाद fixations के लिए, हम अक्सर उपयोग पीएफए है कि पहले से thawed है. प्रारंभिक निर्धारण करने के लिए इस प्रोटोकॉल के साथ सफल धुंधला के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है.
2. Proteinase और POSTFIXATION
- 3 से 12 मिनट के लिए भ्रूण permeabilize आरटी पर proteinase कश्मीर (PBST में 5μg/ml) के साथ डाइजेस्ट. (ऊष्मायन समय भ्रूण की उम्र के रूप में छोटे चरणों और अधिक संवेदनशील हैं पर निर्भर करता है यह भी एंजाइम के बैच पर निर्भर करता है है.) Somitogenesis चरण भ्रूण के लिए, हम आम तौर पर 3-4 मिनट के लिए permeabilize. इस ऊष्मायन के दौरान, हम अपने पक्ष पर microcentrifuge ट्यूब करना.
- PBST में संक्षिप्त कुल्ला और PBST में 5 मिनट के लिए एक बार धोने.
- 4% आरटी में पीबीएस में पीएफए में 20 मिनट के लिए फिर से ठीक है.
- दो बार धो, आरटी पर PBST में 5 मिनट प्रत्येक के लिए.
3. PREHYBRIDIZATION
- 5 मिनट के लिए 65 º सी में भ्रूण सेते HYB.
- HYB में कम से कम 1 घंटे के लिए 65 º सी में Prehybridize +.
4. वर्ण - संकर करना
- लेकिन सभी preHYB के 50 μl निकालें, लेकिन पूरी तरह से जलमग्न भ्रूण रखने सुनिश्चित करें.
- धीरे ट्यूब flicking द्वारा भ्रूण और मिश्रण करने के लिए प्रत्येक riboprobe के 1-2 μl (digoxygenin और riboprobes fluorescein लेबल) जोड़ें. जांच की राशि आम तौर पर एक 20μl जांच संश्लेषण प्रतिक्रिया से 1-2μl.
- देखते हुए कि fluorescein प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, ट्यूब एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे होना चाहिए या अन्यथा इस बिंदु से आगे कम से कम प्रकाश उजागर करने के लिए.
- 65 º सी. पर भ्रूण रातोंरात सेते
5. जांच हटाने
ध्यान दें कि इस बिंदु आगे कमी डिटर्जेंट से समाधान. डिटर्जेंट का उन्मूलन धुंधला प्रतिक्रियाओं की मदद प्रतीत होता है, लेकिन भ्रूण बल्कि चिपचिपा बनने के लिए कारण.
- Riboprobe निकालें.
- 50% formamide/2xSSC में 65 º सी में 2 एक्स 30 मिनट धो लें.
- 2 एक्स एसएससी में 65 º सी में 15 मिनट के लिए धोएं.
- 30 मिनट 0.2 x एसएससी में 65 º सी के लिए धोएं.
6. विरोधी fluorescein एंटीबॉडी ऊष्मायन
- 500μl 1x Maleic एसिड बफर प्लस 2% अवरुद्ध अभिकर्मक (अभिकर्मकों की तालिका देखें) के एक समाधान में आरटी पर कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लॉक.
- विरोधी fluorescein-POD एंटीबॉडी, के रूप में Roche द्वारा आपूर्ति अवरुद्ध समाधान में एक 1:500 कमजोर पड़ने पर जोड़ें.
- 4 º सी. पर रातोंरात सेते इस ऊष्मायन के दौरान, हम अपने पक्ष पर microcentrifuge ट्यूब करना.
- 1x Maleic एसिड बफर में 4 x 20 मिनट धो लें. पीबीएस में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोएं.
7. Fluorescein-लेबल जांच का पता लगाने
- TSA प्लस fluorescein समाधान में 30-60 मिनट सेते हैं. (TSA सब्सट्रेट नीचे धुंधला समाधान करने से पहले प्रतिक्रिया के लिए स्पिन, tyramide अभिकर्मक 1:50 Perkin एल्मर प्रवर्धन मंदक बफर में जलमिश्रित.) इस ऊष्मायन के दौरान, हम अपने पक्ष पर microcentrifuge ट्यूब करना. रिएक्शन समय हर जांच के लिए निर्धारित empirically चाहिए. दुर्भाग्य से, धुंधला प्रतिक्रिया नेत्रहीन हो सकता है के रूप में सब्सट्रेट फ्लोरोसेंट है निगरानी नहीं कर सकते हैं, और एक धुंधला हो जाना प्रतिक्रिया भर सर्वव्यापी हरी प्रतिदीप्ति देखेंगे.
- 10 मिनट प्रत्येक के लिए 30%, 50%, 75% और पीबीएस में 100% मेथनॉल में धो डालें.
- % 1 एच 2 के एक 30 मिनट के लिए मेथनॉल के समाधान में 2 0 में सेते पहली peroxidase निष्क्रिय .
- 75%, 50% और पीबीएस में 30% मेथनॉल में 10 मिनट प्रत्येक धो लें. फिर पीबीएस में 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो लो. यह महत्वपूर्ण है कि मुलाकात कीhanol हटा दिया है.
TYRAMIDE संकेत प्रवर्धन पर टिप्पणियाँ:
हम Perkin एल्मर TSA किट का उपयोग किया गया. हम पाते हैं कि Alexa Tyramide substrates अच्छी तरह से दाग Perkin एल्मर प्रवर्धन मंदक बफर का उपयोग, लेकिन हम सफलता धुंधला Invitrogen / आण्विक जांच किट के साथ प्रदान की बफर का उपयोग नहीं किया है. अन्त में, हमने पाया है कि Cy5 प्रतिदीप्ति बाद मेथनॉल / एच 2 हे 2 उपचार द्वारा समाप्त हो रहा है जबकि fluorescein और alexa-647 अप्रभावित रहे हैं. Cy3 भी प्रतिकूल / मेथनॉल एच 2 हे 2 उपचार के रूप में यह structurally Cy5 करने के लिए संबंधित है द्वारा प्रभावित हो सकता है . इस कारण के लिए, Cy5 Cy3 और TSA प्रतिक्रियाओं केवल एक डबल फ्लोरोसेंट में स्वस्थानी प्रोटोकॉल में दूसरा धुंधला प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
8. विरोधी Digoxygenin एंटीबॉडी ऊष्मायन
- भ्रूण फिर 1x Maleic एसिड बफर प्लस 2% अवरुद्ध अभिकर्मक की एक समाधान में आरटी पर कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लॉक.
- विरोधी डीआईजी पॉड एंटीबॉडी के रूप में एक 1:1000 कमजोर पड़ने पर ऊपर समाधान अवरुद्ध में Roche द्वारा आपूर्ति जोड़ें
- 4 º सी. पर रातोंरात सेते इस ऊष्मायन के दौरान, हम अपने पक्ष पर microcentrifuge ट्यूब करना.
- 1x Maleic एसिड बफर में 4 x 20 मिनट धो लें. पीबीएस में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोएं.
9. Digoxygenin - लेबल जांच का पता लगाने
- (TSA सब्सट्रेट नीचे स्पिन धुंधला समाधान बनाने से पहले प्रतिक्रिया के लिए, प्रवर्धन मंदक बफर में tyramide 1:50 अभिकर्मक पतला.) TSA में 30-60 मिनट प्लस Cy5 समाधान इस ऊष्मायन के दौरान सेते हैं, हम अपने पक्ष पर microcentrifuge ट्यूब करना. रिएक्शन समय हर जांच के लिए निर्धारित empirically चाहिए.
- PBST में 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं.
10. PROPIDIUM आयोडाइड धुंधला हो जाना
- 2 एक्स एसएससी में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धोएं.
- 30 मिनट के लिए 37 पर भ्रूण सेते ° सी में 50 μl 10 μl RNase (100μg/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए) के साथ 2 x SSCT.
- आरटी में 2 x एसएससी में 3 मिनट प्रत्येक के लिए छह बार धोएं.
- 2 एक्स एसएससी में 330μg/ml propidium आयोडाइड के समाधान में 8 मिनट के लिए भ्रूण दाग.
- आरटी में 2 x एसएससी में 3 मिनट प्रत्येक के लिए छह बार धोएं.
- 4% आरटी में पीबीएस में पीएफए में 20 मिनट के लिए ठीक है.
- दो बार धो, आरटी पर PBST में 5 मिनट प्रत्येक के लिए.
11. बढ़ते
- 25% में 10 प्रत्येक और PBST में 50% ग्लिसरॉल मिनट के लिए भ्रूण को सेते हैं. 4 º सी. पर 75% ग्लिसरॉल में रात भर साफ़
- हम काटना और भ्रूण deyolk और फ्लैट उन्हें एक खुर्दबीन स्लाइड पर माउंट. जर्दी महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उत्पादन कर सकते हैं. विच्छेदन बहुत आसान बाद भ्रूण ovenight gylcerol में मंजूरी दे दी है है.
समाधान:
| PBST | पीबीएस प्लस 0.1% बीच | |
| SSCT | एसएससी प्लस 0.1% बीच | |
| HYB - | 50% formamide 5xSSC 0.1% बीच 20 | |
| HYB + | HYB - 5mg/ml torula (खमीर) शाही सेना 50μg/ml हेपरिन | torula आरएनए proteinase कश्मीर पाचन द्वारा शाही सेना के साथ तैयार है बाद phenol, phenol के क्लोरोफॉर्म -, और क्लोरोफॉर्म extraction.The आरएनए उपजी है और DEPC इलाज पानी में भंग. |
| 1 x Maleic एसिड बफर | 150mm Maleic एसिड, 100mm NaCl (7.5 पीएच) |
चित्रा 1 पूरे माउंट के प्रतिनिधि परिणाम डबल स्वस्थानी संकरण में फ्लोरोसेंट. (एसी). छवियाँ दस somite मंच पर एक zebrafish भ्रूण के पीछे क्षेत्र के माध्यम से एक एकल confocal अनुभाग दिखा. इस दृश्य के साथ शीर्ष पर पूर्वकाल पृष्ठीय है. Propidium आयोडाइड के साथ नाभिक दाग नीला रंग हैं. (ए) deltaC mRNA एक digoxygenin लेबल riboprobe और TSA-Cy5 अभिकर्मक का उपयोग कर पता चला था. (बी) her1 जीन से लिखित mRNA एक fluorescein लेबल riboprobe और TSA-fluorescein अभिकर्मक के साथ पाया गया था. (सी) हरे और लाल चैनल मर्ज असंदिग्ध रूप से अलग या अतिव्यापी दो जीन जीन अभिव्यक्ति के क्षेत्रों की पहचान. (डी, ई) her1 अभिव्यक्ति का विस्तार इस प्रक्रिया के उच्च संकल्प का प्रदर्शन . MRNA की subcellular स्थानीयकरण स्पष्ट रूप से discerned किया जा सकता है. Arrowheads सक्रिय प्रतिलेखन प्रदर्शन सेल नाभिक में धुंधला के डॉट्स द्वारा पता चला संकेत मिलता है. तीर एक mRNA की cytoplasmic स्थानीयकरण दिखा सेल संकेत मिलता है. (एफ, जी) her1 और deltaC के लिए डबल धुंधला कोशिकाओं है कि दोनों (सफेद arrowhead) जीन, या अलग (लाल और हरी arrowheads) जीन transcribing कर रहे हैं पता चलता है.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल जांच है कि 30-45 मिनट के लिए एक ठेठ alkaline फॉस्फेट मध्यस्थता प्रतिक्रिया में धुंधला के बाद एक स्वच्छ मजबूत संकेत देने के साथ अच्छी तरह से काम करता है. पूर्व स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में फ्लोरोसेंट प्रदर्शन करने के लिए, हम हमेशा हमारे मानक प्रोटोकॉल गैर फ्लोरोसेंट (जांच संश्लेषण प्रोटोकॉल के साथ साथ पूरक सामग्री में प्रदान) का उपयोग कर जांच का परीक्षण. हम स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में फ्लोरोसेंट के साथ कम सफलता मिली जब कमजोर जांच का उपयोग कर, लेकिन यह कुछ मामलों में संभव हो सकता है. हम सफलतापूर्वक 3 β-catenin के immunolocalization साथ स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में है फ्लोरोसेंट संयुक्त. जब इस बदलाव का प्रदर्शन, हम करते हैं HYB - HYB + और 55 में संकरण incubations ° सी बजाय 65 साल की डिग्री सेल्सियस के रूप में epitopes के लिए बेहतर कम तापमान पर संरक्षित किया जा दिखाई देते हैं. immunolocalization incubations TSA प्रतिक्रियाओं के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं.
चूंकि fluorescein-लेबल जांच आम तौर पर कर रहे हैं एक digoxygenin लेबल वही जीन के लिए जांच की तुलना में कमजोर, हम आम तौर पर जांच fluorescein लेबल पहली कल्पना. एक उदाहरण है जहां एक digoxygenin जांच पहले कल्पना करना चाहते हो सकता है अगर एक दो जीनों के एक कम स्तर पर व्यक्त की है. इस मामले में, एक कमजोर जीन और इसके लिए पहले दाग शोर करने के लिए संकेत को अधिकतम करने के लिए digoxygenin riboprobe बनाता है. नोट है कि अगर आप fluorescein जांच दूसरा कल्पना, आप के रूप में विरोधी - fluorescein एंटीबॉडी पहचान TSA के रूप में riboprobe fluorescein लेबल के रूप में अच्छी तरह से दाग digoxygenin जांच fluorescein TSA के साथ नहीं होना चाहिए कल्पना.
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Acknowledgments
हम इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में Dörthe Julich, जेनिफर दौर और एंड्रयू मारा के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं. अनुसंधान NICHD, अमेरिकन कैंसर सोसायटी और ऑफ डाइम्स के मार्च के द्वारा सहायता प्रदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
