Summary
Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.
Abstract
Montar toda
Protocol
1. FIXAÇÃO
- Fixar os embriões durante a noite a 4 ° C com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS.
- Remover corrigir e lave 2 x PBS, 5 minutos cada em temperatura ambiente (RT).
- Embriões manualmente dechorionate na PBS em uma placa de vidro com a pinça depressão relojoeiro. Depois dechorionation, os embriões são transferidos usando um fogo-de vidro polido pipeta Pasteur, pois podem ficar com pipetas de polipropileno.
- Transferência de embriões através de uma série de 25%, 50% e metanol 75% em PBS por 5 minutos cada.
- Substituir o líquido com metanol 100%, incubar 5 minutos e em seguida, substitua com metanol fresco.
- Lugar embriões a -20 ° C por um mínimo de uma hora. (Normalmente, incubar os embriões durante a noite. Padrão de hibridização in situ funcionará em embriões armazenados há mais de um ano, mas não temos examinado se a alta resolução da hibridização fluorescente in situ é perdido por armazenamento prolongado.)
- Lavar embriões por 5 minutos cada em 75%, 50%, metanol 25% em PBST na RT. Lavar duas vezes por 5 minutos cada, em PBST na RT.
- Fix novamente por 20 minutos em PFA 4% em PBS a RT.
- Lavar duas vezes por 5 minutos cada, em PBST na RT.
NOTA SOBRE PFA:
Nós armazenamos PFA 4% em alíquotas a -20 º C (ver tabela de reagentes). Para a fixação inicial, só usamos PFA que nunca tenha sido previamente descongeladas. Para fixações posteriores, muitas vezes usamos PFA que tenha sido previamente descongeladas. A fixação inicial parece ser crítico para a coloração de sucesso com este protocolo.
2. Proteinase e POSTFIXATION
- Digest com proteinase K (5μg/ml em PBST) a RT por 3 a 12 minutos para permeabilizar os embriões. (O tempo de incubação depende da idade dos embriões como estágios mais jovens são mais sensíveis. Também depende do lote de enzima.) Para embriões em estágio somitogenesis, nós tipicamente permeabilizar por 3-4 minutos. Durante esta incubação, nós colocamos o tubo de microcentrífuga de lado.
- Lave brevemente em PBST e lave uma vez por 5 minutos em PBST.
- Fix novamente por 20 minutos em PFA 4% em PBS a RT.
- Lavar duas vezes, por 5 minutos cada, em PBST na RT.
3. PREHYBRIDIZATION
- Incubar os embriões durante 5 minutos a 65 º C em HYB.
- Prehybridize a 65 º C durante pelo menos 1 hora em HYB +.
4. HIBRIDIZAÇÃO
- Remover todos, mas 50 ul do preHYB, mas certifique-se de manter os embriões completamente submerso.
- Adicione 1-2 mL de cada riboprobe (digoxigenina e fluoresceína marcado riboprobes) para os embriões e misture delicadamente flicking do tubo. A quantidade de sonda é tipicamente 1-2μl de uma reação 20μl da sonda de síntese.
- Dado que a fluoresceína é sensível à luz, os tubos devem ser embrulhados em papel alumínio ou expostos à luz mínima a partir deste ponto em diante.
- Incubar os embriões durante a noite a 65 º C.
5. REMOÇÃO PROBE
Note-se que as soluções a partir deste ponto em diante a falta de detergente. Eliminação de detergente aparece para ajudar as reações de coloração, mas faz com que os embriões para se tornar um pouco pegajosa.
- Remover o riboprobe.
- Lave 2 x 30 minutos a 65 º C em formamide/2xSSC 50%.
- Lavar por 15 minutos a 65 º C em 2 x SSC.
- Lavagem para 30 minutos 65 º C em 0,2 x SSC.
6. ANTI-Fluoresceína incubação com anticorpo
- Bloco para pelo menos 1 hora em temperatura ambiente em 500μl de uma solução de 1x tampão de ácido maleico, mais 2% de reagente de bloqueio (ver tabela de reagentes).
- Adicione o anticorpo anti-fluoresceína-POD, como fornecido pela Roche, na diluição 1:500 em solução de bloqueio.
- Incubar overnight a 4 º C. Durante esta incubação, nós colocamos o tubo de microcentrífuga de lado.
- Lavar 4 x 20 minutos em tampão ácido maleico 1x. Lavar duas vezes por 5 minutos cada em PBS.
7. DETECÇÃO DE fluoresceína DOS RÓTULOS PROBE
- Incubar 30-60 minutos em solução de fluoresceína TSA Plus. (Spin para baixo substrato TSA antes de fazer solução de coloração. Para a reação, diluir o reagente tiramida 1:50 em tampão Perkin Elmer diluente de amplificação.) Durante esta incubação, nós colocamos o tubo de microcentrífuga de lado. Tempo de reação devem ser determinadas empiricamente para cada sonda. Infelizmente, a reação de coloração não pode ser visualmente monitorado como o substrato é fluorescente, e vai ver uma fluorescência verde onipresentes em toda a reação de coloração.
- Lavagem para 10 minutos cada em 30%, 50%, 75% e 100% de metanol em PBS.
- Incubar em uma solução de 1% H 2 0 2 em metanol por 30 minutos para inativar a peroxidase em primeiro lugar.
- Lavar 10 minutos cada em 75%, 50% e metanol 30% em PBS. Em seguida, lave duas vezes para 10 minutos cada em PBS. É importante que todos os conhecihanol ser removido.
NOTAS SOBRE A amplificação de sinal tiramida:
Temos vindo a utilizar a Perkin Elmer Kits TSA. Nós achamos que os substratos Alexa-tiramida mancha bem usando a Perkin Elmer tampão diluente amplificação, mas não tiveram sucesso usando o buffer fornecido com a coloração Kits Invitrogen / Molecular Probes. Por fim, descobrimos que fluorescence Cy5 é eliminada por subseqüentes 2 O metanol / H 2 tratamento, enquanto fluoresceína e Alexa-647 não são afetados. Cy3 também pode ser adversamente afetado pela 2 O metanol / H 2 tratamento, uma vez que está estruturalmente relacionado com Cy5. Por esta razão, Cy3 e Cy5 reações TSA só deve ser utilizado para a reação de coloração segundo de uma fluorescente duplo em protocolo situ.
8. ANTI-digoxigenina incubação com anticorpo
- Bloco os embriões novamente por pelo menos uma hora em temperatura ambiente em uma solução de 1x tampão de ácido maleico mais 2% de reagente de bloqueio.
- Adicione o anticorpo anti-DIG POD como fornecidos pela Roche na diluição de 1:1000 em solução de bloqueio acima
- Incubar overnight a 4 º C. Durante esta incubação, nós colocamos o tubo de microcentrífuga de lado.
- Lavar 4 x 20 minutos em tampão ácido maleico 1x. Lavar duas vezes por 5 minutos cada em PBS.
9. DETECÇÃO DE digoxigenina-DOS RÓTULOS PROBE
- Incubar 30-60 minutos em TSA Além disso Cy5 Solution (Spin para baixo substrato TSA antes de fazer solução de coloração. Para a reação, diluir o reagente tiramida 1:50 em tampão diluente amplificação) Durante esta incubação, nós colocamos o tubo de microcentrífuga de lado. Tempo de reação devem ser determinadas empiricamente para cada sonda.
- Lavar três vezes por 10 minutos cada, em PBST.
10. Propídio COLORAÇÃO iodeto
- Lavar duas vezes por 5 minutos cada, em 2 x SSC.
- Incubar os embriões durante 30 minutos a 37 ° C em 50 mL 2 x SSCT com 10 mL de RNAse (para uma concentração final de 100μg/ml).
- Lavar seis vezes por 3 minutos cada, em 2 x SSC a RT.
- Mancha embriões por 8 minutos em uma solução de iodeto de propídio 330μg/ml em 2 x SSC.
- Lavar seis vezes por 3 minutos cada, em 2 x SSC a RT.
- Correção para 20 minutos em PFA 4% em PBS a RT.
- Lavar duas vezes, por 5 minutos cada, em PBST na RT.
11. MONTAGEM
- Incubar os embriões para 10 minutos cada em 25% e glicerol a 50% em PBST. Claro durante a noite em glicerol 75% a 4 º C.
- Dissecamos e deyolk os embriões e plana montá-los em uma lâmina de microscópio. A gema pode produzir fluorescência de fundo significativo. Dissecção é muito mais fácil depois de os embriões terem desaparecido ovenight em gylcerol.
SOLUÇÕES:
| PBST | PBS Tween mais 0,1% | |
| SSCT | SSC Tween mais 0,1% | |
| HYB- | Formamida 50% 5xSSC 0,1% Tween-20 | |
| HYB + | HYB- 5mg/ml torula (levedura) RNA 50μg/ml de heparina | O RNA torula é preparado por proteinase K digestão de RNA com fenol subseqüentes, do fenol-clorofórmio, clorofórmio e-extraction.The RNA é precipitado e dissolvido em água tratada DEPC-. |
| 1 x tampão ácido maleico | 150mm de ácido maleico, NaCl 100mM (pH 7,5) |
Figura 1. Os resultados representativos do monte todo dupla hibridização fluorescente in situ. (AC). Imagens mostram uma única seção confocal com a região posterior de um embrião de peixe-zebra na fase de dez somito. A vista é dorsal anterior com o topo. Coradas com iodeto de propídio núcleos são de cor azul. (A) deltaC mRNA foi detectada usando um riboprobe digoxigenina-rotulados e TSA-Cy5 reagente. (B) mRNA transcrito do gene HER1 foi detectado com um riboprobe fluoresceína rotulados e TSA-fluoresceína reagente. (C) A fusão dos canais verde e vermelho identifica inequivocamente regiões distintas da expressão do gene ou sobreposição dos dois genes. (D, E) Detalhe da HER1 expressão demonstrando a alta resolução deste procedimento. Localização subcelular de mRNA pode ser claramente discernida. As setas indicam uma célula exibindo transcrição ativa, revelado por pontos de coloração no núcleo. Setas indicam uma célula mostrando a localização citoplasmática de mRNA. (F, G) coloração duplo HER1 e deltaC revela células que são a transcrição de ambos os genes (seta branca), ou seja gene separadamente (setas vermelhas e verdes).
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Discussion
O protocolo apresentado aqui funciona bem com sondas que dar um sinal forte limpa após coloração por 30-45 minutos em uma fosfatase alcalina mediada típico de reação. Antes de realizar a fluorescente no protocolo de hibridização in situ, sempre testamos nossas sondas utilizando o protocolo não fluorescente padrão (desde que no material suplementar juntamente com o protocolo de síntese de sonda). Temos tido menos sucesso com as fluorescentes em protocolo de hibridização in situ utilizando sondas quando mais fraco, mas pode ser possível em alguns casos. Temos combina com sucesso as fluorescentes em protocolo de hibridização in situ com imunolocalização de β-catenina 3. Ao realizar esta variação, nós fazemos o HYB, HYB + e incubações hibridação a 55 ° C em vez de 65 ° C como a epítopos parecem ser preservado melhor à temperatura mais baixa. As incubações imunolocalização são realizados após as reações TSA.
Desde fluoresceína sondas marcadas são geralmente mais fracos do que uma sonda marcada com digoxigenina para o mesmo gene, geralmente visualizar a sonda fluoresceína marcado primeiro. Uma instância onde se pode querer visualizar a sonda digoxigenina primeira é se um dos dois genes é expressa em um nível baixo. Neste caso, se faz um digoxigenina riboprobe para o gene fraco e manchas para ele primeiro a maximizar o sinal ao ruído. Note que se você visualizar a segunda sonda de fluoresceína, não se deve visualizar a sonda digoxigenina com fluoresceína TSA como o anticorpo anti-fluoresceína irá reconhecer o TSA mancha, bem como a fluoresceína riboprobe-rotulados.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer as contribuições de Dorthe Jülich, Round Jennifer e Mara Andrew no desenvolvimento deste protocolo. Apoio à pesquisa fornecido pelo NICHD, a Sociedade Americana do Câncer ea March of Dimes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
