Summary
Details Methoden zur hochauflösenden Ca
Abstract
Ca 2 +-Imaging der glatten Muskulatur gibt einen Einblick in die zellulären Mechanismen, die zu keiner Änderung des Membranpotentials, wie die Freisetzung von Ca 2 + aus dem internen Speicher führen kann, und ermöglicht es mehreren Zellen gleichzeitig überwacht werden, um zu beurteilen, z. B. Kopplung in Syncytial Gewebe. Subzellulären Ca 2 +-Transienten sind in der glatten Muskulatur gemeinsamen, aber nur schwer genau zu messen, weil der Probleme, die durch ihre stochastische Ereignis entstanden, über ein oft großes Sehfeld, in ein Organ, das es anfällig für Vertrag. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine Reihe von Imaging-Protokolle und-Analyse-Routinen zu erwerben und dann zu analysieren entwickelt, in einer automatisierten Weise, die Häufigkeit, Ort und Amplitude von solchen Ereignissen. Während dieser Ansatz auch in anderen Kontexten angewendet werden können, beinhaltet unsere eigene Arbeit den Nachweis von lokalen purinergen Ca 2 +-Transienten zur Ortung Sender Release mit Submikron-Auflösung.
ATP ist als cotransmitter von vegetativen Nerven, bindet dort an P2X1-Rezeptoren auf den glatten Muskelzellen des Detrusors und Samenleiter freigegeben. Ca 2 + in die glatten Muskelzellen, was zu purinergen neuroeffector Ca 2 +-Transienten (NCTS). Der Schwerpunkt Ca 2 +-Transienten ermöglichen die optische Überwachung der Freisetzung von Neurotransmittern in einer Weise, die viele Vorteile gegenüber der Elektrophysiologie hat. Abgesehen von der stark verbesserten räumlichen Auflösung, hat optische Erfassung der zusätzlichen Vorteil, dass die Aufnahme des Senders Entlassung aus vielen unterscheidbaren Seiten gleichzeitig. Darüber hinaus ist die optische Fokusebene leichter zu pflegen oder zu korrigieren während der langen Aufnahme-Serie ist als die Neupositionierung von einem intrazellulären scharfen Mikroelektroden.
Zusammenfassend ist ein Verfahren zur Abbildung von Ca 2 +-Fluoreszenz beschrieben, die Details der Vorbereitung des Gewebes und die Erfassung und Analyse von Daten. Wir skizzieren den Einsatz mehrerer Skripte für die Analyse solcher Ca 2 +-Transienten.
Protocol
Teil 1: Vorbereitung der Ca 2 +-Indikator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM)
- Oregon Green 488 BAPTA-1.00 kommt in 500 ul Fläschchen als eine kleine Menge (50 g) Pulver. Zugabe von 40 ul Pluronic F-127-Lösung, um das Pulver unter leichtem Schütteln für 30 s, dann fügen Sie 460 ul PSS, und leicht schütteln für 30 s. Die endgültige Lösung bietet 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, 4 x 125 ul Aliquots. Vor Lichteinwirkung und bei -20 C.
Teil 2: Ca 2 + loading
- Entfernen Sie die Ca 2 +-Indikator (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) aus dem (-20 C) Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen lassen.
- Nehmen Sie 1 ml der PSS in einem Reagenzglas und in Wasserbad. Bubble mit 95% O 2 / 5% CO 2 bei einer Rate von etwa 1 Blase erscheinen pro Sekunde. Die Bubbler muss in das Reagenzglas mit einem Stopfen oder mit Parafilm zB gesichert werden.
- Präparieren Sie die Gewebe aus der Tier-und in einer Sylgard gesäumten Petrischale vorsichtig Bindegewebe. Unabhängig von der glatten Muskulatur Orgel Art, sollte PSS alle 10 Minuten ersetzt werden und Gewebe sollte gut gewaschen werden (zB durch den Austausch des PSS dreimal) folgende Zerlegung. Für die Samenleiter: Betrachten Sie schneiden die Orgel Länge-Möglichkeiten, um ein Blatt Gewebe zu erzeugen. Für die Harnblase: open in Längsrichtung von der Blasenhals (posterior) an die Spitze der Kuppel (anterior). Bereiten Sie vier Streifen, von 6 bis 8 mm lang und 1 bis 2 mm breit, entlang der dorsalen Oberfläche des Detrusor, Schneiden in die Richtung des dominanten Muskelbündel.
- Legen Sie sezierten Gewebes in der "vorgewärmt und sprudelte 'PSS.
- Add 125 ul 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, um das Reagenzglas und gib ein wenig zu schütteln, von Hand zu mischen.
- Fortsetzen Blasenbildung und verlassen, mit Folie abgedeckt. Die Zeit ist dauert genügend Gewebe für die Aufnahme der Ca 2 +-Indikator variiert mit der Größe des Gewebes und die Dicke der glatten Muskulatur. Zum Beispiel: 70 min (Maus Detrusor, Ratte anococcygeus) bis 120 Minuten (Ratte Detrusor, Maus Samenleiter).
Teil 3: Vorbereiten des 'Ca 2 + geladen "Gewebe für die Mikroskopie
Sorgfältige Pinning des Gewebes ist notwendig, um spontane Bewegung des Gewebes (eine Eigenschaft der Abbildung von glatten Muskelzellen aus relativ intaktes Gewebe) zu minimieren und die Lage eines geeigneten Standortes für die Bildgebung (wie ein flaches Stück Gewebe kann zu erleichtern notwendig befragten in zwei Dimensionen statt drei).
- Spülen Sie das Gewebe in sprudelte PSS für mindestens 5 Minuten.
- Berg in Sylgard gesäumten Vorbereitung Teller, Dehnung der Gewebe (leicht) zu einer flachen Schicht bilden. Verwenden Sie keine langen "Pins", dass das Ziel kratzen kann, verwenden Sie stattdessen kurze Längen von 25-50 Mikrometer Durchmesser Silberdraht als "Stifte" und legen Sie in einem Winkel.
- Position der Vorbereitung Schüssel auf dem Mikroskoptisch, wobei darauf geachtet, um sicherzustellen, dass die PSS nicht von der Sylgard gesäumten Bereich der Schale escape (da dies zu einer großen Fläche in PSS, wenn die Superfusion beginnt abgedeckt Blei).
- Schalten Sie die Pumpe, um die Vorbereitung mit PSS superfuse. Eine Rate von 100 ml pro Stunde wird oft verwendet.
- Schalten Sie das Heizgerät.
- Legen Sie die Zu-und Abfluss Rohre und Temperaturfühler an der Vorbereitung Schale (Befestigung eines jeden auf das Metallband durch den Magneten auf ihrer Basis). Die Höhe der Spitze des Ablassrohr bestimmt die Tiefe des PSS. Achten Sie darauf, dass der Ausfluss ist eigentlich das Entfernen PSS (wie es manchmal zunächst nicht).
- Stellen Sie die Temperatur auf dem Heizgerät auf die gewünschte Temperatur, z. B. 33-35 C erreichen
- Lassen Sie das Gewebe für mindestens 10 Minuten ausgleichen.
Teil 4: Auswahl von Ort zu Bild
Die Exposition gegenüber Anregungsbeleuchtung wird der Indikator photobleach, so vermeiden Sie die Verwendung für mehr als ein paar Sekunden zu einer Zeit.
- Mit einem Low-Power-Objektiv (10x oder 20x) zu verwenden Epifluoreszenz, spannend mit einem blauen Licht, um die glatte Muskulatur ansehen und identifizieren eine geeignete Region zu überwachen. Versuchen Sie, eine Website basierend auf Pick: Bewegung (die sollte minimal sein) und die Anzahl der glatten Muskelzellen in das Feld ein. Helle "Strukturen" kann eine hohe Anzahl von "false positives" in das Bild Erkennungsalgorithmus verursacht, so vermeiden mit einer großen Anzahl von (zB) durchsetzt Epithelzellen oder Fibroblasten.
- Wechseln Sie zu einer höheren Macht Ziel (40x).
- Drehen der Bühne oder der optischen Achse, so dass die glatten Muskelzellen (s) liegt horizontal (dh parallel zur schnellen Scan-Achse).
Teil 5: Die konfokale Mikroskopie
Die Details, wie die konfokale Mikroskop 'set up "sind spezifisch für jeden Mikroskop-Typ, aberdie wichtigsten Überlegungen sind: Geschwindigkeit (mindestens 5 Hz ist für die meisten Ca 2 +-Transienten erforderlich); Auflösung und Größe des Feldes (die beide gehandelt werden-off mit Geschwindigkeit). Einige der folgenden Protokoll ist spezifisch für eine Leica SP2 aufrecht konfokalen Mikroskop. Ein typisches Protokoll: 100 Frame-Serie, bei 5 Hz (256 x 256 Pixel, ca. 100 x 100 um.) Erworben oder 13,5 Hz (256 x 64 Pixel, ca. 100 x 25 um.). Der Tastkopf eingestellt bidirektional verschieben (zum Erwerb Geschwindigkeit maximieren) und erwerben bei 1000 Hz pro Zeile.
- Schließen Sie das Loch mit einem "luftigen disk '.
- Stellen Sie den Laser (488 nm) Leistung zwischen 25 und 35% auf den AOTF, dieser Wert ist ein Trade-off zwischen Helligkeit und Ausbleichen. (Letzteres ist ein besonderes Problem bei langen Aufnahmen.)
- Erwerben sechs Serien pro Standort, und 4-6 Seiten pro "Behandlung". Es ist üblich, in Zukunft den gleichen sechs Standorten pre-Medikament (das heißt "Kontrolle") und Post-drug-Monitor, obwohl signifikante Bleichen kann der Experimentator von dieser abweichen.
- Es ist wichtig, mit Ca 2 +-Imaging, die "Zeit Kontrollen" durchgeführt werden.
Teil 6: Vorbereitung für die Analyse
- Downloaden und installieren Sie Image J aus: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Laden Sie die Plattform-spezifische Version, und aktualisieren Sie dann auf die neueste Version durch Herunterladen der neuesten imageJ.jar Datei von http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar und ersetzt die alte Datei. Apple Mac Benutzer: wenn es langsam läuft, sicherzustellen, dass Sie die neueste Version der Java Virtual Machine (JVM) von Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
- Herunterladen Excel_writer.jar von: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html und installieren Sie in den Plugins [Verzeichnis]> jar-Verzeichnis.
- Kopieren Sie die folgenden Dateien in das Plugins-Verzeichnis: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installieren Sie jedes dieser Skripte mit den Plugins [Menü]> Makros> Installieren ... Funktion von ImageJ.
- Wir verwenden eine Leica SP2 konfokalen Mikroskop, die Software (Leica LCS), für die jeder Serie erzeugt als eine einzige sichtbare 'movie' innerhalb der Software, sondern spart als einzelne Frames. Zur Rekonstruktion Frames in Serie: (i) Stellen Sie sicher, dass alle die 'Frames' zu rekonstruieren sind in einem einzigen Ordner (zB "DataFolder> Tiffs '). (Ii) Wählen Sie Plugins [Menü]> Makros> Leica_SP2_Stacker. Wählen Sie das Root-Verzeichnis (zB 'DataFolder'). Wählen Sie den gewünschten Ordner aus der Dropdown-Liste (zB "Tiffs / '). Wählen Sie eine Ausgabe-Verzeichnis oder ein neues generieren (z. B. "DataFolder> Stacks '). Das Skript wird dann rekonstruieren Serie von Einzelbildern.
Teil 7: Korrektur für Bewegung
Obwohl Bewegung der abgebildeten Seite mit guten Pinning minimiert werden kann und gleichmäßig gedehnt Gewebe, zeigen einige der glatten Muskulatur Organe spontanen Kontraktionen, die nicht durch eine sorgfältige Pinning allein abgeschafft werden können. Hier beschreiben wir die Verwendung eines frei verfügbaren Algorithmus, oder richtet Spielen Frames innerhalb einer Serie.
- Download 'StackReg "(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) und" TurboReg "(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
- Installieren Sie jedes in das Plugins-Verzeichnis mit den Plugins> Makros> Install ...
- Legen Sie einen Stapel zu verarbeiten (File> Open ...) und dann auf einen Rahmen, der deutlich zeigt, das Feld von Interesse zu bewegen. Weitere Bilder werden auf diese Referenzrahmen ausgerichtet werden.
- Plugins> Stacks> StackReg. Versuchen Sie, jeden der verschiedenen "Transformationen" (dh Translation, Rigid Body, Scaled Rotation, Affine) zu bestimmen, was am wirksamsten ist. (Weitere Details: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Teil 8: Particle Detection Algorithmus
Für jede "Standort" abgebildet werden Faktoren variieren, die Auswirkungen auf den Nachweis von Ca 2 +-Transienten. Durch die Messung bestimmter Eigenschaften von jedem Standort ("Partikelparameter" - siehe unten), ist der Prozess der Erkennung erleichtert. So für jeden Standort, "abgezogen Schwelle für" berechnet man, "Schwelle für Ratio" und "Zelle Kantenschwelle".
- Plugins [Menü]> Makros> Installieren ... und wählen Sie "JNCT0.08Release.ijm".
- Plugins [Menü]> Makros> load-Stack (Abkürzung: l). Wählen Sie eine Serie und berechnen Partikelparameter:
- a. Schwelle für subtrahiert (= Hintergrund)
- Wählen Sie einen rechteckigen ROI über das, was Sie glauben, 'background' werden.
- Measure (Abkürzung: m). Notieren Sie bedeuten.
- b. Berechnung Schwelle für Verhältnis
- Wählen Sie einen rechteckigenROI um eine optisch ebene Fläche der Zelle (n).
- Measure (Abkürzung: m). Notieren Sie Mittelwert und Standardabweichung.
- Wiederholen Sie noch zwei Mal OR können Sie drei Felder auf einmal zu ziehen, indem Sie "Shift".
- Berechnen und notieren Schwelle für ratio = (1 + SD / Mittelwert) x 32, im Durchschnitt Werte aus den drei Wiederholungen / sites.
- c. Zell Kantenschwelle
- Image> Stacks> Z-Projekt ... Wählen Sie Projektionstyp: "Mittlere Intensität"
- Bild> Anpassen> Schwellenwert.
- Wählen Sie Schwarz und Weiß.
- Definieren 'unter' (obere Schieber) zu begrenzen und notieren Sie sich den entsprechenden Wert (auf der rechten Seite des Schiebers). Nur Ereignisse, die in den schwarzen Regionen gezählt werden.
- Klicken Sie auf "Reset".
- Analyse-Stacks (Shortcut: 2)
- Wählen Sie nur eine Serie zu diesem Zeitpunkt, dh die "erste Datei 'und' last file 'sollten die gleichen sein.
- Geben Sie die Werte der "Schwelle für abgezogen", "Schwelle für Ratio" und "Zelle Kantenschwelle". Lassen Sie andere Einstellungen auf die Standardwerte zurückgesetzt.
- Der Algorithmus erzeugt einen Dual-Fenster Fenster, in dem die bearbeiteten Serie auf der linken Seite angezeigt wird und das Original auf der rechten Seite. Sorgfältig durch diese gehen, um die Anzahl von Fehlalarmen und die Gelegenheiten, bei denen Ereignisse mit bloßem Auge sichtbar, nicht erkannt wurden zu beurteilen. Um eine genauere Erkennung von Ca 2 +-Transienten kann es erforderlich sein, um leicht anpassen einige der "Partikelparameter". Während der Prozess ein wenig "hit and miss" erscheinen mag auf den ersten Versuch, eine bekommt schnell ein Gefühl, was Parameter-Schlüssel.
- Für jede Serie liefert der Algorithmus eine Excel-Datei, die Details Eigenschaften der erkannten Ereignis (wie Amplitude, Fläche und Lage). 'False Positives' - entfernt werden, kann von Hand, aus dieser Excel-Datei - mit der Durchsicht der Bilddateien, dass der Algorithmus Ausgänge (z. B. Schritt 8.17) identifiziert.
Discussion
Wahl der fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator
Oregon Green 488 BAPTA-1.00 wurde als Ca 2 +-Indikator gewählt, weil es (i) ist hell im Vergleich zu anderen Indikatoren (zB Fluo-4 und Calcium Green) 1, (ii) ist empfindlich auf physiologische Veränderungen in Ca 2 +-Konzentration mit einem K d in einer ähnlichen Größenordnung 1 auf die intrazelluläre Ca 2 +-Konzentration [Ca 2 +] i (z. B. der Samenleiter 2), (iii) lädt viele glatte Muskelzellen, so dass glatte Muskelzellen Kopplung überwacht werden. Allerdings ist Oregon Green 488 BAPTA-1.00 eine nicht-ratioable Ca 2 +-Indikator und als solche kann nicht einfach benutzt, um die absolute bestimmen [Ca 2 +] i. Darüber hinaus kann es auch Puffer Ca 2 +, wenn in hohen Konzentrationen und gesättigt mit hoher Amplitude Veränderungen in [Ca 2 +] i.
Die Hemmung der spontanen Kontraktilität
Die spontane Kontraktilität der glatten Muskulatur Organe können pharmakologisch reduziert werden, wie durch die Blockierung der Bewegung des Ca 2 + durch L-Typ Ca 2 +-Kanäle (z. B. durch: Nifedipin 3; Diltiazem 4). Beachten Sie, dass diese Medikamente wird erheblich reduziert die Amplitude der whole-cell Ca 2 + Blitze / Transienten.
Die Kontraktion der Samenleiter resultiert aus einer Kombination von allem purinergen und noradrenerge Neurotransmission. Focal Ca 2 +-Transienten in diesem Gewebe sind jedoch unempfindlich gegenüber noradrenergen-Rezeptor-Blockade (z. B. α 1-Adrenozeptor, durch Prazosin 5) so Bewegung ohne Beeinträchtigung der Schwerpunkt Ca 2 +-Transienten reduziert werden kann.
Alternativ können Kontraktion verhindert "Downstream" durch die Hemmung der Myosin Light Chain Kinase zB durch Wortmannin 6 sein.
Schlussfolgerungen
Überwachung Ca 2 +-Fluoreszenz bei Submicron Auflösung ist eine leistungsfähige Technik, um die post-junctional Auswirkungen der Freisetzung von Neurotransmittern 5,7-Studie und die Freisetzung von Ca 2 + aus dem internen Speicher (z. B. "Funken" 8). Die Analyse der Ca 2 +-Transienten mit der beschriebenen Vorgehensweise ist dabei kostengünstig im Vergleich zu handelsüblichen Bildanalyse-Pakete und ermöglicht maßgeschneiderte Analyse durch individuelle schriftliche Java-Plugins für ImageJ.
Disclosures
Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der verwendeten Tiere und ihr Leiden zu minimieren, alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den britischen Animals (Scientific Procedures) Act 1986 und der Europäischen Gemeinschaften die Richtlinie 86/09/EEC durchgeführt.
Acknowledgments
Der Wellcome Trust finanziell unterstützt (VIP Award JSY und 074128 Research Fellowship an KLB). Medical Research Council Stipendium an RJA
Leica_SP2_Stacker, ein Algorithmus verwendet, um TIFFs für den "Wiederaufbau" in eine Reihe zu importieren, ist auf Leica_tiff_sequence, ein Plugin für das Lesen Leica SP2 TIFFs in ImageJ, von Tony Collins entwickelt und verwendet mit seiner Erlaubnis basiert.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg und TurboReg werden Algorithmen verwendet, um für die Bewegung des Gewebes zu korrigieren, auf Th venaz und Kollegen (1998) 9 basiert.
Excel_writer.jar wurde von Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html) geschrieben.
JNCT0.08JoVE.ijm, die Partikel Algorithmus, basiert auf einem Algorithmus von KL Gehirn schriftlich und detailliert bisher 5 basiert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport Corp. | M-VW-3046-OPT-012140 | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
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