מיקוד Ca ^{2 +} איתור חלוף של שריר חלק

Summary

פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה Ca

Abstract

Ca ^{2 +} הדמיה של שריר חלק מספק תובנה מנגנוני הסלולר כי לא עלולה לגרום לשינויים של פוטנציאל הממברנה, כמו שחרורו של Ca ^{2 +} מחנויות פנימי, ומאפשר מספר תאים בו זמנית כדי להיות במעקב על מנת להעריך, למשל, צימוד סינסיציאלי רקמות. Subcellular Ca ^{2 +} הארעיים נפוצים שריר חלק, אך קשה למדוד במדויק בגלל הבעיות שנגרמות על ידי התרחשות סטוכסטיים שלהם, על פני שדה רחב של נוף לעתים קרובות, באיבר שהוא נוטה להתכווץ. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו סדרה של פרוטוקולים הדמיה רוטינות ניתוח לרכוש ולאחר מכן לנתח, באופן אוטומטי, את תדירות, מיקום משרעת של אירועים כאלה. בעוד גישה זו ניתן להחיל בהקשרים אחרים, העבודה שלנו כרוך זיהוי של המקומיים purinergic Ca ^{2 +} הארעיים לאיתור לשחרר משדר עם רזולוציה submicron.

ה-ATP משוחרר כמו cotransmitter מן העצבים האוטונומית, שם הוא נקשר לקולטנים P2X1 על השריר החלק של detrusor ואת הזרע הזרע. Ca ^{2 +} מזין את השרירים החלקים, וכתוצאה מכך purinergic neuroeffector Ca ^{2 +} הארעיים (NCTs). מוקד Ca ^{2 +} הארעיים לאפשר ניטור אופטי של שחרור הנוירוטרנסמיטר באופן יש יתרונות רבים על electrophysiology. מלבד ההחלטה מרחבית השתפרו מאוד, הקלטה אופטי יש יתרון נוסף המאפשר הקלטה של ​​שחרור משדר להבדיל מאתרים רבים בו זמנית. יתר על כן, מטוס אופטי של המוקד הוא קל יותר לתחזק או לתקן במהלך סדרת הקלטה ארוך יותר הוא מחדש של microelectrode חד תאיים.

לסיכום, שיטת הדמיה של Ca ^{2 +} הקרינה מתוארת בו פרטים הכנת הרקמה, ורכישת וניתוח של נתונים. אנו המתאר את השימוש של מספר תסריטים לניתוח כזה Ca ^{2 +} הארעיים.

Protocol

חלק 1: הכנת Ca ^{2 +} מדד (אורגון גרין 488 BAPTA, 01:00)

1. אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 מגיע 500 מבחנות μl כמו כמות קטנה (50 מיקרוגרם) של אבקה. הוסף 40 μl Pluronic F-127 הפתרון אבקה, מנערים בעדינות למשך 30 שניות, ולאחר מכן להוסיף 460 PSS μl, וללחוץ בעדינות במשך 30 s. הפתרון הסופי, 10 מיקרומטר אורגון גרין 488 BAPTA-01:00, מספק 4 x 125 aliquots μl. המנעו מחשיפה לאור החנות ב -20 C.

חלק 2: Ca ^{2 +} טעינה

1. הסר את Ca ^{2 +} מדד (אורגון גרין 488 BAPTA, 01:00) מהמקפיא (-20 C) ולאפשר להפשיר בטמפרטורת החדר.
2. קח 1 מ"ל של PSS במבחנה ובמקום באמבט מים. הבועה עם 95% O ₂ / 5% CO ₂ בקצב של בועה סביב 1 המופיעים לשנייה. Bubbler צריך להיות מאובטח לתוך במבחנה, למשל עם פקק או עם Parafilm.
3. מנתחים את הרקמה מן החיה, בצלחת פטרי Sylgard מצופה, להסיר בזהירות רקמת חיבור. ללא קשר לסוג האיבר שריר חלק, PSS יש להחליף כל 10 דקות ורקמות יש לשטוף היטב (למשל על ידי החלפת PSS שלוש פעמים) לנתיחה שלאחר מכן. במשך הזרע הזרע: לשקול חיתוך איבר באורך דרכים לייצר גיליון של רקמות. עבור בשלפוחית ​​השתן: לפתוח longitudinally מהצוואר שלפוחית ​​השתן (האחורי) לחלק העליון של הכיפה (הקדמי). הכינו ארבעה פסים, 6 - 8 מ"מ ארוך 1-2 מ"מ רוחב, על פני השטח הגבי של detrusor, חיתוך לכיוון של חבילות השריר הדומיננטי.
4. המקום גזור רקמה ב 'טרום התחמם מבעבע "PSS.
5. הוסף 125 μl של 10 מיקרומטר אורגון גרין 488 BAPTA-1 בבוקר עד במבחנה ולתת לנער קטן, ביד, לערבב.
6. קורות חיים מבעבע ולעזוב, מכוסה בנייר כסף. הפעם הוא לוקח רקמות מספיק לקחת את Ca ^{2 +} אינדיקטור משתנה בהתאם לגודל של רקמות עובי שכבת השריר החלק. לדוגמה: 70 דקות (עכבר detrusor, anococcygeus חולדה) עד 120 דקות (detrusor חולדה, מוליכי הזרע העכבר).

חלק 3: הכנת "Ca ^{2 +} טעון" רקמה במיקרוסקופ

זהירות מצמיד הרקמה הוא הכרחי על מנת לצמצם תנועה ספונטנית של הרקמות (תכונה של הדמיה של תאים שריר חלק מרקמת תמים יחסית) כדי להקל על מיקום האתר מתאים הדמיה (כמו פיסה שטוחה של רקמה ניתן שנסקרו בשני ממדים, במקום שלושה).

1. שוטפים את הרקמה PSS מבעבע במשך לפחות 5 דקות.
2. הר בצלחת Sylgard מצופה הכנה, מתיחת הרקמה (במעט) כדי ליצור דף שטוח. הימנע משימוש ארוך "סיכות" שעלולים לשרוט את המטרה: להשתמש באורכים קצרים במקום 25-50 מיקרומטר קוטר חוט כסף כמו "סיכות" והכנס בזווית.
3. מקמו את צלחת הכנה על הבמה מיקרוסקופ, נזהר על מנת להבטיח כי PSS לא לברוח מהאזור Sylgard מצופה של המנה (כמו זה עשוי להוביל שטח גדול להיות מכוסה PSS, כאשר superfusion מתחיל).
4. הפעל את המשאבה על מנת superfuse ההכנה עם PSS. קצב של 100 מ"ל לשעה מועסק לעתים קרובות.
5. הפעל את יחידת החימום.
6. מניחים את יבוא ו יצוא צינורות בדיקה הטמפרטורה על צלחת ההכנה (הדבקת לכל רצועת מתכת על ידי המגנט על בסיסו). גובה קצה הצינור יצוא יקבע את עומק PSS. תיזהר על מנת להבטיח כי יצוא הוא בעצם הסרת PSS (כפי שהיא עושה לעיתים לא בהתחלה).
7. הגדר את הטמפרטורה על יחידת החימום כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה, למשל 33-35 ג
8. אפשר הרקמה לאזן לפחות 10 דקות.

חלק 4: מבחר האתר תמונה

חשיפה תאורה עירור יהיה photobleach מחוון, לכן הימנע משימוש במשך יותר מכמה שניות בכל פעם.

1. עם מטרה צריכת חשמל נמוכה (10x או 20x) להשתמש epifluorescence, מרגש עם אור כחול, כדי להציג את שריר חלק לזיהוי אזור מתאים לפקח. נסו לבחור באתר מבוסס על: תנועה (שאמור להיות מינימלי) ומספר לתאי שריר חלק בתחום. "מבנים" ברייט עלול לגרום מספר גבוה של "תוצאות חיוביות שגויות" באלגוריתם זיהוי תמונה, כדי להימנע באתרים עם מספר גדול של (למשל) בתאי אפיתל או fibroblasts וביניהם.
2. מעבר אל המטרה חשמל גבוה (40X).
3. סובב את הבמה או את הציר האופטי כך תא שריר חלק (ים) שקרים האופקי (כלומר מקביל לציר סריקה מהירה).

חלק 5: מיקרוסקופיה confocal

הפרטים של איך מיקרוסקופ confocal הוא "להקים" הם ספציפיים לכל סוג המיקרוסקופ, אבלהשיקולים העיקריים הם: מהירות (מינימום של 5 הרץ נדרש רוב Ca ^{2 +} הארעיים); רזולוציה וגודל השדה (שניהם נסחרים-off עם מהירות). חלק פרוטוקול הבאה היא ספציפית מיקרוסקופ הלייקה SP2 confocal זקוף. פרוטוקול טיפוסית: 100 סדרה מסגרת, רכשה ב 5 הרץ (256 x 256 פיקסלים, כ 100 x 100 מיקרומטר.) או 13.5 הרץ (256 x 64 פיקסלים, כ 100 x 25 מיקרומטר.). ראש סריקה להגדיר להעביר דו directionally (על מנת למקסם את מהירות הרכישה) ולרכוש ב 1000 הרץ בכל שורה.

1. סגור את חריר ל 'דיסק אוורירי' אחד.
2. הגדרת (488 ננומטר) לייזר הכוח בין 25 ו 35% על AOTF; ערך זה trade-off בין הבהירות photobleaching. (האחרון להיות בעיה מסוימת במהלך הקלטות ארוך.)
3. רוכשת שש סדרות בכל אתר, 4-6 אתרים לכל "טיפול". זה נפוץ לכוון לאותו צג שישה אתרים טרום תרופה ("מלאה" כלומר) ופוסט התרופה, למרות photobleaching משמעותי עלול לגרום הנסיין לסטות הזה.
4. זה חיוני עם Ca ^{2 +} הדמיה כי "שולטת זמן" מבוצעות.

חלק 6: הכנה לניתוח

1. הורד והתקן J תמונה מתוך: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. הורד את הגרסה פלטפורמה ספציפית, ולאחר מכן לעדכן לגרסה העדכנית ביותר על ידי הורדת הקובץ imageJ.jar האחרונים http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, להחליף את הקובץ הישן. Apple משתמשי מקינטוש: אם זה פועל לאט, ודא שאתה משתמש בגירסה העדכנית של מכונת ג'אווה וירטואלית (JVM) זמין מ Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. הורד Excel_writer.jar מ: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html ולהתקין לתוך תוספים [מדריך]> מדריך צנצנת.
3. העתק את הקבצים הבאים לתוך ספריית Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. התקן כל התסריטים הללו באמצעות תוספים [תפריט]> מאקרו> התקן ... פונקציה של ImageJ.
4. אנו משתמשים SP2 לייקה מיקרוסקופ confocal, התוכנה (לייקה LCS) אשר מייצר כל סדרה כמו "סרט" יחיד לצפייה בתוך התוכנה, אבל חוסך כמו מסגרות בודדים. כדי לשחזר מסגרות לסדרה: (i) יש לוודא כי כל "מסגרות" להיות משוחזר הם בתיקייה אחת (למשל "DataFolder> המריבות"). (Ii) בחירת תוספים [תפריט]> מאקרו> Leica_SP2_Stacker. בחר את ספריית השורש (למשל "DataFolder '). בחר את התיקיה הרצויה מהרשימה הנפתחת ("המריבות /" למשל). בחר את ספריית הפלט או ליצור אחד חדש ("DataFolder> סטאקס" למשל). התסריט אז יהיה לשחזר סדרה של מסגרות בודדים.

חלק 7: תיקון לתנועה

למרות התנועה של האתר הדמיה עשויה להיות ממוזער עם מצמיד טוב רקמות באופן שווה, מתוח, כמה איברים התכווצויות שריר חלק תערוכה ספונטנית כי לא ניתן לבטל על ידי זהיר מצמיד לבד. כאן אנו מתארים את השימוש של אלגוריתם זמין באופן חופשי כי מיישרת גפרורים או מסגרות בתוך שורה.

1. הורד "StackReg" (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ו 'TurboReg "(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. התקן כל לתוך ספריית Plugins באמצעות תוספים> פקודות מאקרו> התקן ...
3. טען ערימה להיות מעובד (File> Open ...) ולאחר מכן לעבור למסגרת זה מראה בבירור את תחום עניין. מסגרות אחרות יהיה מיושר מסגרת התייחסות זו.
4. תוספים> סטאקס> StackReg. נסו כל אחד "טרנספורמציות" שונים (תרגום כלומר, גוף קשיח, סיבוב Scaled, המאוחד) כדי לקבוע מה הוא היעיל ביותר. (פרטים נוספים: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

חלק 8: אלגוריתם זיהוי חלקיקים

עבור כל "אתר" צילמו, גורמים משתנים המשפיעים על זיהוי של Ca ^{2 +} הארעיים. באמצעות מדידת מאפיינים מסוימים של כל אתר ('פרמטרים החלקיקים "- להלן מפורט), תהליך הזיהוי הקל. לכן עבור כל אתר, אחת מחשבת "סף מופחתים", "סף יחס 'ו' קצה תא הסף".

1. תוספים [תפריט]> מאקרו> התקן ... ובחר 'JNCT0.08Release.ijm ".
2. תוספים [תפריט]> מאקרו> לטעון מחסנית (קיצור: l). בחר סדרה ולחשב פרמטרים החלקיקים:
   1. א סף מופחתים (רקע =)
3. בחר ROI מלבני על מה שאתה מאמין להיות "רקע".
4. מדוד (קיצור: מ '). הערה למטה מתכוון.
   1. ב חישוב סף עבור יחס
5. בחר מלבניההחזר על ההשקעה באזור שטוח אופטית של התא (ים).
6. מדוד (קיצור: מ '). הערה סטייה ממוצעת ומטה סטנדרטי.
7. חזור נוספת פעמיים או שאתה יכול לצייר שלוש קופסאות בבת אחת על ידי לחיצה על "שינוי".
8. חישוב לרשום סף עבור יחס = (1 + SD / אומר) x 32, ממוצע הערכים משלושת משכפל / אתרים.
   1. ג קצה סלולריים הסף
9. תמונה> סטאקס> Z פרויקט ... בחר את סוג הקרנה: "ממוצע עוצמת"
10. תמונה> התאם סף>.
11. בחר שחור ולבן.
12. הגדרת "תחת" (המחוון העליון) להגביל לרשום את הערך המתאים (מימין המחוון). רק אירועים המתרחשים באזורים שחור ייספרו.
13. לחץ על 'איפוס'.
14. נתח את ערימות (קיצור: 2)
15. בחר רק סדרה אחת בשלב זה, כלומר "הקובץ הראשון 'ו' הקובץ האחרון" צריך להיות זהה.
16. הזן ערכים של 'הסף מחוסר' סף עבור יחס 'ו' קצה תא הסף ". עזוב הגדרות אחרות ב ערכי ברירת המחדל שלהם.
17. האלגוריתם יהיה לייצר חלון כפול חלונית שבה סדרה מעובד מוצג משמאל המקורית בצד ימין. בזהירות לעבור את זה כדי להעריך את מספר תוצאות חיוביות שגויות לבין מקרים שבהם האירועים, נראה בעין, לא זוהו. כדי לקבל זיהוי מדויק יותר של Ca ^{2 +} הארעיים ייתכן שיהיה צורך להתאים במקצת חלק מה 'פרמטרים החלקיקים ". אמנם התהליך עשוי להיראות "פגע להחמיץ" קצת על הניסיון הראשון, אחד במהירות מקבל תחושה לגבי מה הפרמטרים הם המפתח.
18. עבור כל סדרה, האלגוריתם מייצר קובץ Excel פרטים מאפיינים של האירוע זיהה (כגון אזור משרעת, ואת המיקום). "תוצאות חיוביות שגויות" - מזוהה על ידי בדיקת קבצי תמונה כי פלטי אלגוריתם (למשל צעד 8.17) - ניתן להסיר, ביד, זה מקובץ Excel.

Discussion

הבחירה של פלורסנט Ca ^{2 +} אינדיקטור

אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 נבחר Ca ^{2 +} אינדיקטור כי (i) הוא בהיר לעומת אינדיקטורים אחרים (למשל Fluo-4 ו הירוק סידן) ¹ (ii) הוא רגיש לשינויים פיזיולוגיים ריכוז Ca ^{2 +} עם _ד K בסדר גודל דומה ¹ אל תאיים Ca ^{2 +} בריכוז [Ca ^{2 +]} i (למשל של מוליכי הזרע ²⁾ (iii) המון תאים רבים שריר חלק, מה שמאפשר לתא השריר החלק צימוד להיות במעקב. עם זאת, אורגון גרין 488 BAPTA-01:00 הוא לא ratioable Ca ^{2 +} אינדיקטור, וככזה לא יכול בקלות לשמש כדי לקבוע המוחלט [Ca ^{2 +]} _אני. יתר על כן, היא עשויה גם חיץ Ca ^{2 +} אם בריכוזים גבוהים הופך רווי שינויים משרעת גבוהה [Ca ^{2 +]} _אני.

עיכוב של contractility ספונטני

Contractility ספונטנית של איברים שריר חלק עשוי להיות מופחת פרמקולוגית, כגון על ידי חסימת התנועה של Ca ^{2 +} דרך סוג L-Ca ^{2 +} ערוצי (למשל על ידי: nifedipine ^3; diltiazem ^4). שים לב כי תרופות אלו יהיה לצמצם במידה ניכרת את המשרעת של כל תא Ca ^{2 +} גלי / הארעיים.

התכווצות של הזרע הזרע נובע משילוב של עצבית purinergic בעיקר noradrenergic. מיקוד Ca ^{2 +} הארעיים ברקמה זו, עם זאת, רגישות המצור קולטן noradrenergic (למשל α ₁ adrenoceptor, על ידי prazosin ^5), כך התנועה עשוי להיות מופחת מבלי להשפיע על מוקדי Ca ^{2 +} הארעיים.

לחילופין, ניתן למנוע התכווצות 'במורד הזרם' דרך עיכוב של שרירן למשל שרשרת אור קינאז ידי wortmannin ^6.

מסקנות

ניטור Ca ^{2 +} הקרינה בבית submicron רזולוציה היא טכניקה רבת עוצמה כדי לחקור את הפוסט junctional ההשפעות של שחרור הנוירוטרנסמיטר ^5,7 ו שחרורו של Ca ^{2 +} מחנויות פנימיים (למשל "ניצוצות" ^8). הניתוח של Ca ^{2 +} הארעיים באמצעות מתודולוגיה המפורטים כאן היא חסכונית בהשוואה, זמין מסחרית חבילות ניתוח התמונה ומאפשר תפורים אישית באמצעות ניתוח בכתב plugins Java עבור ImageJ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 solution	Invitrogen	P3000MP	20% solution in DMSO
Leica SP2 upright confocal microscope	Leica Microsystems
Air table (‘vibration isolated workstation’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning