焦点のCa ^{2 +過渡検出}

Summary

高解像度のCaの詳細方法

Abstract

^の Ca 2 ^は、平滑筋の⁺イメージングは、内部貯蔵から^の Ca 2 ⁺の放出のような膜電位の変化、という結果に可能性細胞メカニズムへの洞察を提供し、同時に監視する複数の細胞は、例えば、評価することができます、のカップリング合胞体組織。細胞内のCa ^{2 +}過渡電流は平滑筋では一般的ですが、まだ契約にそれが発生しやすい、その臓器で、ビューの多くの場合幅広い分野にわたって、原因確率論的な発生に起因する問題の正確な測定が困難である。この問題を克服するために、我々は、自動化された形で、そのような事象の頻度、位置と振幅を取得し、解析するイメージングプロトコルと分析の一連のルーチンを開発しました。このアプローチは他のコンテキストに適用されるかもしれないが、私たち自身の仕事は、ローカルプリンのCa ²の検出⁺サブミクロンの分解能で伝達物質の放出を検索するための過渡状態を含む。

ATPは、それが排尿筋と輸精管の平滑筋上のP2X1受容体に結合する自律神経、から共存伝達物質として放出される。 ^{のCa 2 +}プリン神経効果器のCa ^{2 +}過渡（NCTS）で、その結果、平滑筋に入ります。焦点のCa ^{2 +}過渡電気生理学よりも多くの利点を持っている方法で、神経伝達物質の放出の光学的モニタリングを可能にする。離れて大幅に向上空間分解能から、光記録は、同時に多くの識別可能なサイトからの伝達物質の放出の記録を可能にするという利点もあります。さらに、焦点の光学面は維持または細胞内鋭い微小電極の再配置よりも長時間録音のシリーズの間に修正する方が簡単です。

要約すると、 ^{カルシウム}のイメージング⁺蛍光のための方法が概説されている細部組織の準備、およびデータの収集と分析。我々は、例えばCa ^{2 +}過渡電流の解析のためのいくつかのスクリプトの使用を概説する。

Protocol

パート1：のCa ^{2 +}インジケーター（AMオレゴングリーン488 BAPTA - 1）の調製

1. オレゴングリーン488 BAPTA - 1は、AM粉の少量（50μg）をとして500μlのバイアルで提供されます。粉体へのF - 127ソリューション、30秒間静かに揺れ40μlのプルロニックを追加し、その後、460μlのPSSを追加し、30秒間振とうする最終的な解決には、10μMオレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは、4 ×125μlのアリコートを提供します。 -20℃での光とストアへの暴露を避ける

パート2：のCa ^{2 +}ローディング

1. （-20℃）冷凍庫からのCa ^{2 +}インジケーター（オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AM）を削除し、室温で解凍することができます。
2. 試験管や水浴の場所でPSSの1mlを取る。秒あたりに現れる約1バブルの速度で95％O ₂ / 5％CO ₂のバブル。バブラーは、栓、またはパラフィルムで、例えば試験管、に保護する必要があります。
3. 動物から組織を摘出し、、Sylgardライニングペトリ皿に、慎重に結合組織を取り除く。関係なく、平滑筋臓器のタイプの、PSSは10分ごとに交換する必要があり、組織は、（PSS三回を交換するなど）だけでなく、以下の郭清を洗浄する必要があります。輸精管の場合：ティッシュのシートを生産する器官の長さの方法を切削することを検討してください。膀胱用：ドームの上部（前方）に膀胱頸部（後方）から縦方向に開く。 8 LONG mmおよび1 - - 支配的な筋肉の束の方向に切断排尿筋の背側表面に沿って幅2 mmの4つのストリップ、6を準備します。
4. "事​​前に暖めとバブル"PSSで切除した組織を置きます。
5. 10μMオレゴングリーン488 BAPTA - 1は試験管の午前の125μlを加え、少し振る、手で、ミックスする。
6. 箔で覆われ、バブリングと休暇を再開する。時間は、Ca ^2を取るのに十分な組織のために引き継ぎます⁺インジケーターは、組織と平滑筋の層の厚さのサイズによって異なります。例えば：120分（ラットの排尿筋、マウス輸精管）へ70分（マウス排尿筋、ラットのanococcygeus）。

パート3："Ca ^{2 +は} 、ロードされた"顕微鏡のための組織の準備

組織のピニング慎重になることが組織の自発運動（相対的に無傷の組織から平滑筋細胞のイメージングのプロパティ）を最小限に抑え、組織のフラットな作品として撮影するのに適したサイト（の位置を容易にするために必要です。二次元ではなく3つ）で調査した。

1. 少なくとも5分間バブリングPSSの組織をすすいでください。
2. 平らなシートを形成するために組織を（わずかに）ストレッチ、Sylgardライニング準備皿にマウントします。 "ピン"として25から50ミクロン径の銀線の代わりに短い長さを使用し、斜めに挿入し、目標を傷つけることがある長い"ピン"を使用することは避けてください。
3. PSSは、皿のSylgardが並ぶエリア（これは、灌流の開始時に、PSSで覆われて大面積を招く場合があります）から逃れることがないように注意しながら、顕微鏡のステージ上に準備皿を置きます。
4. PSSで準備を表面かん流するために、ポンプのスイッチを入れる。時間当たり100mlの速度は、しばしば採用されている。
5. ヒーターユニットに切り替えます。
6. 準備の料理（その基盤上に磁石で金属片にそれぞれ貼付）に流入し、流出管及び温度プローブを置きます。流出管の先端の高さは、PSSの深さを決定します。流出が実際に（それは時々最初にしないとして）PSSを除去していることを確認するように注意してください。
7. 、所望の温度に到達するためのヒータユニット上に、例えば33から35℃を温度を設定する
8. 組織は、少なくとも10分間平衡させる。

パート4：画像へのサイトの選択

励起光源への暴露はインジケータが退色しますので、一度に数秒以上使用しないようにしてください。

1. 低消費電力を目的とし（10倍または20倍）平滑筋を表示し、監視するために適切な領域を識別するために、青色光で励起する、落射蛍光使用。運動（最小限でなければなりません）とフィールドでの平滑筋細胞の数：に基づいてサイトを選んでみてください。明るい"構造は"画像の検出アルゴリズムで"偽陽性"の高い数を引き起こすことがありますので、（例えば）散在上皮細胞または線維芽細胞の数が多いサイトにアクセスしないように。
2. より高い電力の目標（40倍）に切り替えます。
3. ステージや平滑筋細胞（の）ので、光軸を回転させる（高速走査軸に、すなわち平行）、水平位置。

パート5：共焦点顕微鏡

共焦点顕微鏡は、"設定"する方法の詳細については、各顕微鏡の種類に固有のものですが、重要な考慮事項は次のとおりです。スピード（5 Hzの最小はほとんどのCa ^{2 +}過渡に必要とされる）、フィールドの解像度とサイズ（速度とオフ取引されどち ​​らも）。次のプロトコルのいくつかは、ライカSP2直立共焦点顕微鏡に固有のものです。典型的なプロトコルです：5 Hzの（256 × 256ピクセル、約100 ×100μmである。）で取得した100フレームのシリーズ、または13.5 Hzの（256 × 64ピクセル、約100 ×25μmと。）。走査ヘッドは双方向に移動する（取得速度を最大にする）と、行ごとに1000 Hzで取得するように設定。

1. 1つの"エアリーディスク"にピンホールを閉じて。
2. AOTFで25〜35％の間レーザー（488 nm）のパワーを設定します。この値は、明るさと光退色との間のトレードオフです。 （後者は長時間録音時に特定の問題である。）
3. "治療"あたり6つのサイト - 六つのサイトあたりのシリーズ、および4を取得する。かなりの退色は、実験者はこのから逸脱する可能性がありますが、それは、事前に薬剤（すなわち"コントロール"）とポスト薬剤同じ6つのサイトを監視することを目的とするのが一般的です。
4. それは、"タイムコントロール"が実行されることのCa ^{2 +}イメージングとが不可欠です。

第6部：分析のための準備

1. http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html：からイメージJをダウンロードしてインストールします。プラットフォーム固有のバージョンをダウンロードしてから、http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jarから最新のimageJ.jarファイルをダウンロードし、古いファイルを置き換えることにより、最新のバージョンにアップデートする。アップルMacユーザー：それは徐々に実行される場合は、アップル（http://www.apple.com/macosx/features/java/）から入手可能なJava仮想マシン（JVM）の最新バージョンを使用していることを確認。
2. からExcel_writer.jarダウンロード：http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.htmlをしてプラグイン[ディレクトリ]> jarファイルのディレクトリにインストールします。
3. ; JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class：以下のファイルをPluginsディレクトリにコピーします。プラグインを使用して、これらの各スクリプトをインストール[メニュー]>マクロ>のインストール... ImageJの機能。
4. 私たちは、ライカSP2共焦点顕微鏡、ソフトウェア内の単一の表示可能な"映画"として、各系列を生成するためのソフトウェア（ライカLCS）を使用しますが、個々のフレームとして保存されます。シリーズにフレームを再構成するために：（i）は再構築されるすべての"フレーム"は、単一のフォルダ（例："DataFolder>原告"）になっていることを確認します。 （ⅱ）プラグイン[メニュー]>マクロ> Leica_SP2_Stackerを選択してください。ルートディレクトリ（例えば'DataFolder'）を選択してください。ドロップダウンリスト（たとえば、'TIFFを/"）から目的のフォルダを選択します。出力ディレクトリを選択するか、新しいものを（例えば、'DataFolder>スタック"）を生成します。スクリプトは、個々のフレームからシリーズを再構築します。

パート7：運動を補正

画像化されたサイトの動きが良くピンニングと最小化と均一に延伸組織されることがありますが、一部の平滑筋臓器は単独でピニング慎重で廃止することができる自発的な収縮を示す。ここでは、整列またはシリーズ内でのフレームと一致して自由に利用可能なアルゴリズムの使用を説明しています。

1. "StackReg"（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）と"TurboReg"（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）をダウンロードしてください。
2. プラグインを使用してプラグインディレクトリにそれぞれをインストールする>マクロ>のインストール...
3. （>開くをファイル...）処理されるようにスタックをロードしてから、明らかに興味のある分野を示していますフレームに移動します。他のフレームは、この基準のフレームに配置されます。
4. プラグイン>スタック> StackReg。最も効果的であるかを判別するために別の"変換"（すなわち翻訳、リジッドボディ、スケール回転、アフィン）のそれぞれを試してみてください。 （更なる詳細：http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）

パート8：粒子の検出アルゴリズム

各"サイトが"イメージングのために、要因は、Ca ^{2 +}トランジェントの検出に影響を与えることが異なります。各サイト（"粒子のパラメータ" - 詳細下記）の特定の特性を測定することにより、検出の処理が促進される。このようにサイトごとに、一つは、"比率のしきい値"と"セルのエッジのしきい値'減算のしきい値"を計算します。

1. プラグインの[メニュー]>マクロ>のインストール... ...と"JNCT0.08Release.ijm"を選択します。
2. プラグインの[メニュー]>マクロ>負荷スタック（ショートカット：L）。シリーズを選択して、パーティクルのパラメータを計算します。
   1. A.減算のためのしきい値（=バックグラウンド）
3. あなたが"背景"であると信じるもの以上の矩形ROIを選択してください。
4. 尺度（ショートカット：M）。平均値ダウンに注意してください。
   1. B.比率の計算しきい値
5. 長方形を選択します。セル（複数可）の光学的に平坦な領域の周りROI。
6. 尺度（ショートカット：M）。平均値と標準偏差を書き留めます。
7. さらに2回繰り返し、ORは"シフト"を押して一度に3つのボックスを描画することができます。
8. 3 /のサイトを複製するから値を平均し、=（1 + SD /平均値）× 32の比率のしきい値を計算し、書き留めておきます。
   1. C.セル端のしきい値
9. 画像>スタック> Zプロジェクト...投影タイプを選択します："平均強度を"
10. 画像>>しきい値を調整します。
11. 黒と白]を選択します。
12. "下"の定義（上側のスライダ）を制限すると、対応する値（スライダーの右側にある）を書き留めておきます。黒の領域で発生するイベントだけがカウントされます。
13. "リセット"をクリックします。
14. スタックを分析（ショートカット：2）
15. この段階で一つのシリーズを選択し、'最初のファイルを"IEと'最後のファイルは、"同じでなければなりません。
16. 、"比率のしきい値"と"セルのエッジのしきい値'を減算するためのしきい値"の値を入力します。それらのデフォルト値で他の設定のまま。
17. このアルゴリズムは、処理系が左側に示されているデュアルペインのウィンドウと右上の元を生成します。慎重に目で見えるイベントは、、検出されていないもので偽陽性と機会の数を評価するためにこの通過。 Ca ^{2 +}のより正確な検出⁺トランジェントを得るためにそれは少し"粒子のパラメータ"のいくつかを調整する必要があります。プロセスは少し"ヒットとミス"を思わ最初の試みでもありますが、人はすぐにパラメータが鍵となるものとして感じを取得します。
18. 各シリーズの場合、アルゴリズムは、Excelファイルを生成することを検出したイベントの詳細特性（振幅、面積や位置など）。 "偽陽性" - このExcelファイルから、手で、削除される可能性がある - アルゴリズムの出力は（例えばステップ8.17）という画像ファイルを確認して識別される。

Discussion

蛍光のCa ^{2 +}指示薬の選択

（ⅱ）のCa ²の生理的変化に敏感である⁺濃度、それは（i）は他の指標（例えばみたFluo - 4、カルシウムグリーン^）1に比べて明るいですので、オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは、Ca ^{2 +}指示薬として選ば ​​れました（ⅲ）負荷、多くの平滑筋細胞、監視されるカップリング平滑筋細胞を可能にする;に細胞内Ca ^{2 +}濃度[Ca ^{2 +]} iの（VASの例は^、2精）同じような大きさ¹のK _dでしかし、オレゴングリーン488 BAPTA - 1 AMは非ratioableのCa ^{2 +}指示薬である、そのように簡単に絶対的に決定するために使用することができます[Ca ^{2 _+]} iの。さらに、それはまた⁺が存在する場合、高濃度でのCa ^2のバッファおよび[Ca ^{2 +]} _iの高振幅の変化で飽和になる可能性があります。

自発的な収縮の阻害

平滑筋臓器の自発的な収縮は、L型Ca ^{2 +}チャネル（：;ジルチアゼム⁴ニフェジピン³によってなど）を通してのCa ^{2 +}の動きをブロックすることとして、薬理学的に減少させることができる。これらの薬物は非常に全細胞のCa ²の振幅⁺点滅/放電時間を短くすることに注意してください。

VASの収縮は主にプリン作動性とノルアドレナリン性神経伝達の組み合わせから結果を精。この組織の焦点のCa ^{2 +}過渡は、しかしながら、ノルアドレナリン受容体遮断（例えば_、α1アドレナリン受容体、プラゾシン⁵による）の動きが焦点のCa ^{2 +}過渡電流に影響を与えずに低減することができるようにすると小文字が区別されません。

また、収縮がワートマニン⁶によりミオシン軽鎖キナーゼなどの阻害を介して"下流"を防止することができる。

結論

サブミクロン分解能でのCa ^{2 +}蛍光を監視することで神経伝達物質放出^5,7の後の接合効果を研究し、Ca ^{2 +}の放出⁺内部 ​​貯蔵（例えば'火花^'8）からする強力な手法です。のCa ^{2 +}過渡解析ここで概説する方法論を使用しては、費用対効果であり、市販の画像解析のパッケージと比較すると、ImageJ用のカスタム記述のJavaプラグインを通じて、カスタムメイドの分析を行うことができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 solution	Invitrogen	P3000MP	20% solution in DMSO
Leica SP2 upright confocal microscope	Leica Microsystems
Air table (‘vibration isolated workstation’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning