Summary
고해상도 CA의 세부 방법
Abstract
CA 2 평활근의 + 영상은 내부 상점에서 칼슘 2 +의 출시로 막 잠재력을 변경 발생하지 않을 수 있습니다 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며, 동시에 모니터하는 여러 세포가 예를 들어, 평가할 수에 커플링 syncytial 조직. Subcellular 칼슘 2 + 과도는 평활근에서 일반적인, 아직 있기 때문에 장기에서보기 종종 다양한 분야를 통해, 그들의 확률적 발생으로 인한 문제의 정확하게 측정하기 어려운 것을 그 계약을하는 경향이. 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 자동 방식으로, 이러한 이벤트의 빈도, 위치 및 진폭을 획득하고 분석하는 이미징 프로토콜과 분석 루틴 일련의 개발했습니다. 이 방법은 다른 상황에서 적용될 수 있지만, 우리 자신의 작품이 지역 purinergic 칼슘 2의 검출과 관련된 submicron 해상도 송신기 자료를 찾는 + 과도.
ATP 그것은 detrusor 및 중이야의 deferens의 평활근에 P2X1 수용체에 바인딩 자율 신경에서 cotransmitter로 배포되고 있습니다. CA 2 + purinergic neuroeffector 칼슘 2 + 과도 (NCTs)의 결과로, 부드러운 근육갑니다. 초점 칼슘 2 + 과도는 전기 생리학 이상의 많은 장점을 가진 방식으로 신경 전달 물질 방출의 광학 모니터링을 허용합니다. 떨어져 크게 개선 공간적 해상도에서 광학 녹음 동시에 여러 구별 사이트에서 송신기 릴리스의 녹음을 허용하는 추가적인 장점이 있습니다. 또한, 초점 광학 비행기 유지하거나 세포 날카로운 microelectrode의 재배치보다 긴 녹화 시리즈 중에 해결하기 쉽습니다.
요약, CA 2 + 형광 이미징을위한 방법을 설명하는 세부 조직의 준비 및 데이터의 수집 및 분석. 우리는 이러한 칼슘 2 + 과도의 분석에 대한 몇 가지 스크립트의 사용을 설명합니다.
Protocol
1 부 : 칼슘 2의 준비는 + 표시 (오레건 그린 488 BAPTA - 1 AM)
- 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 AM 가루를 소량 (50 μg)로 500 μl 병이된다. 가루로 F - 127 솔루션, 30 s에 대한 부드럽게 흔들어 40 μl Pluronic를 추가 후, 460 μl PSS를 추가, 30 S. 위해 부드럽게 흔들 최종 솔루션은 10 μm의 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 여기는, 4 x 125 픽셀 μl aliquots을 제공합니다. -20 C.에 빛을 저장하는 노출을 피하십시오
2 부 : CA 2 + 로딩
- (-20 C) 냉동실에서 칼슘 2 + 표시등 (오레건 그린 488 BAPTA - 1 AM) 제거하고 실온에서 해동 수 있습니다.
- 시험관과 물 욕조에서 장소에 PSS 1 ML 가져가라. 95% O 2 / 5% 초당 나타나지 1 시경 거품의 비율로 CO 2와 버블. 버블러는 벙이나 Parafilm와 예 시험관로 확보해야합니다.
- 동물의 조직을 절개하다하고, Sylgard 늘어선 페트리 접시에, 신중하게 결합 조직을 제거합니다. 없이 부드러운 근육 기관 유형의 PSS는 매 10 분을 대체되어야하며 조직은 (PSS 세 번 교체하여 예) 다음과 같은 절개를 잘 씻어해야합니다. 중이야 deferens의 경우 : 조직의 시트를 생산하는 길이 - 방법 오르간을 절단 고려하십시오. 방광의 경우 : 돔 (앞쪽에)의 상단에 방광 목 (후부)에서 길이 방향 엽니다. 8 mm 길이 1 - - 지배 근육 번들 방향으로 절단 detrusor의 등의 표면을 따라 폭 2mm, 넷 스트립, 6을 준비합니다.
- 장소는 '미리 예열하고 부풀어 오른'PSS의 조직을 해부 했어요.
- 10 μm의 오레곤 그린 488 BAPTA - 1은 시험관 오전 125 μl를 추가하고 약간 대하지, 손으로 혼합합니다.
- 호일로 덮여 버블링과 휴가를, 이력서. 충분한 조직 + 표시기가 평활근 층의 조직과 두께의 크기에 따라 다릅니다 칼슘 2 걸릴 수있는 시간이 걸립니다. 예를 들면 : 120 분 (쥐 detrusor, 마우스의 중이야 deferens) 70 분 (마우스 detrusor, 쥐 anococcygeus).
파트 3 : 현미경의 '칼슘 2 + 로드된'조직을 준비
주의 조직 달아은 조직의 자발적인 움직임을 (상대적으로 손상 조직의 평활근 세포의 이미지의 속성) 최소화 및 이미징에 적합한 사이트의 위치를 (조직의 평면 조각으로 수 있습니다 촉진하기 위하여 필요한 오히려 세 이상의 2 차원)에서 조사.
- 적어도 5 분 대한 부풀어 오른 PSS의 조직을 씻어.
- 플랫 시트를 형성하는 조직을 (약간) 스트레칭, Sylgard 늘어선 준비 접시에 마운트합니다. 목적을 흠집 수 있습니다 긴 '핀'을 사용하지 마십시오; '핀'으로 25-50 μm의 직경 실버 와이어 대신 짧은 길이를 사용하여 각도로 삽입합니다.
- (이 수는 superfusion이 시작 PSS에 적용되는 넓은 지역을 초래할 등) PSS는 접시의 Sylgard 늘어선 지역에서 탈출하지 않도록주의하고, 현미경 단계에 준비 접시를 놓습니다.
- PSS와 준비를 superfuse하기 위해 펌프를 전환합니다. 시간 당 100 ML의 속도는 종종 고용됩니다.
- 히터 장치를 전환합니다.
- 준비 요리 (바닥에있는 자석에 의해 금속 스트립으로 각각 affixing)에 유입 및 유출 튜브 및 온도 프로브를 놓습니다. 유출 튜브의 끝의 높이가 PSS의 깊이를 결정합니다. 유출 사실 (이것은 때로는 처음하지 않는 등) PSS를 제거하도록주의하십시오.
- 원하는 온도, 예를 들어 33-35 C.에 도달 히터 장치에서 온도를 설정
- 조직은 적어도 10 분 대한 평형 수 있습니다.
4 부 : 사이트의 선택 이미지
여기 조명에 노출이 표시기를 photobleach하므로 한 번에 몇 초 이상 사용하지 마십시오.
- 낮은 전력 목적으로 (10X 또는 20x) 평활근을 확인하고 모니터에 적합한 영역을 식별하는, 푸른 빛이 epifluorescence, 흥미 진진한를 사용합니다. 운동 (최소한되어야하는)와 필드에 평활근 세포의 번호에 따라 사이트를 선택하려고합니다. 밝은 '구조'이미지 검색 알고리즘에서 '잘못된 반응'의 높은 숫자를 일으킬 수 있으므로 (예) interspersed 상피 세포 또는 섬유아 세포의 다수와 함께 사이트를 피하십시오.
- 높은 전력 목적 (40x)로 전환합니다.
- 평활근 세포 (S)가 가로 놓여 있도록 (빠른 스캔 축에 즉, 병렬) 단계 또는 광학 축을 회전.
제 5 부 : 공촛점 현미경
의 세부 사항이 공촛점 현미경은 '설정'방법을 각 현미경 유형에 특정 있지만,주요 고려 사항은 다음과 같습니다 속도 (5 Hz의 최소 대부분의 칼슘 2 + 과도 필요합니다) 분야의 해상도와 크기 (둘 중 상장 - 오프 속도로됩니다.) 다음 프로토콜 중 일부는 Leica SP2 똑바로 공촛점 현미경에만 적용됩니다. 일반적인 프로토콜입니다 : 5 Hz에서 (256 X 256 픽셀, 약 100 X 100 μm의.)에서 취득한 100 프레임 시리즈, 또는 13.5 Hz에서 (256 X 64 픽셀, 약 100 X 25 μm의..) 스캔 머리가 이중 directionally 이동 (수집 속도를 극대화하기 위해)와 한 줄에 1,000 Hz에서에서 취득으로 설정.
- 한 '에어리 디스크'로 핀홀을 닫습니다.
- 이 값이 밝기와 photobleaching 사이의 트레이드 오프이며 AOTF 25 35 % 사이 레이저 (488 nm의) 전원을 설정합니다. (후자는 긴 녹음 기간 동안 특정 문제가되고.)
- '치료'최대 6 사이트 - 여섯 사이트마다 시리즈, 4를 취득. 중요한 photobleaching이 실험자이 이탈하는 원인이 될 수 있습니다하지만 그것은 같은 여섯 사이트 사전 약물 (예 : '통제')과 후 약물을 모니터하는 것을 목표로하는 일반적입니다.
- '시간 관리'가 수행되는 칼슘 2 + 이미징 필수 그것을이다.
6 부 : 분석을위한 준비
- http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html : 이미지에서 J를 다운로드하고 설치합니다. 플랫폼 특정 버전을 다운로드 후, http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar에서 최신 imageJ.jar 파일을 다운로드 기존 파일을 대체하여 최신 버전으로 업데이 트합니다. 애플 맥 사용자가 느리게 실행되면, 당신이 애플 (http://www.apple.com/macosx/features/java/)에서 사용할 수있는 자바 가상 머신 (JVM)의 최신 버전을 사용하고 있는지 확인하십시오.
- 에서 Excel_writer.jar 다운로드 : http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html과 [디렉토리]> 병 디렉토리 플러그인으로 설치합니다.
- ; JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class 다음 파일을 플러그인 디렉토리에 복사합니다. 플러그인을 사용하여 이러한 스크립트를 각 설치 [메뉴]> 매크로> 설치 ... ImageJ의 기능을 수행합니다.
- 우리는 소프트웨어 내에서 하나의 볼 '영화'로 각각의 시리즈를 생성하는 Leica SP2 공촛점 현미경, 소프트웨어 (Leica LCS)를 사용하지만, 개별 프레임을 저장합니다. 시리즈로 프레임을 재구성하려면 다음 단계를 따르십시오 (I 것은) 모두 '프레임'이 하나의 폴더 (예 : 'DataFolder가> Tiffs')에 재건된 수 있는지 확인합니다. (2) 플러그인 [메뉴]> 매크로> Leica_SP2_Stacker를 선택합니다. 루트 디렉토리를 선택합니다 (예 : 'DataFolder'). 드롭 다운 목록 (예 : 'Tiffs /')에서 원하는 폴더를 선택합니다. 출력 디렉터리를 선택하거나 새 (예를 들어 'DataFolder> 스택') 생성합니다. 스크립트는 다음 각 프레임에서 시리즈를 재구성합니다.
7 부 : 운동에 대한 수정
몇 군데 사이트의 운동은 잘 걸어와 최소화하고 고르게 - 늘어 조직 수 있지만, 일부 평활근의 장기 혼자 걸어주의에 의해 폐지 수없는 자발적인 수축을 나타냅니다. 여기서 우리는 일련의 시간 프레임을 일치하거나 일치 자유롭게 사용할 알고리즘의 사용을 설명합니다.
- 'StackReg'(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)와 'TurboReg'(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/)을 다운로드합니다.
- 플러그인을 사용하여 플러그인 디렉토리에 각각 설치> 매크로> 설치 ...
- (> 열기 파일 ...) 처리 될 수있는 스택을로드하고 명확하게 관심 분야를 보여주는 프레임으로 이동합니다. 다른 프레임이 참조 프레임에 정렬됩니다.
- 플러그인> 스택스> StackReg. (예 : 번역, 단단한 몸, 줄인다 회전, Affine) 가장 효과적인 결정하기 위해 다양한 '변환'의 각보십시오. (자세한 세부 정보 : http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
8 부 : 입자 검출 알고리즘
각 '사이트'가 몇 군데 들어, 요소 칼슘 2 + 과도의 감지에 영향을 미칠 것이 달라집니다. 각 사이트 ( '입자 매개 변수'- 자세한 이하)의 특정 속성을 측정하여 검출하는 과정이 촉진됩니다. 그리고 '셀 모서리 임계값'그러므로 각 사이트에 대해 하나의 계산 '에 대한 임계값은 빼는', '비율에 대한 임계값.
- 플러그인 [메뉴]> 매크로> 설치 ... 그리고 'JNCT0.08Release.ijm'을 선택합니다.
- 플러그인 [메뉴]> 매크로> 부하 스택 (단축키 : L). 시리즈를 선택하고 입자 매개 변수를 계산 :
- A. 에 대한 임계값 (= 배경) 빼서
- 당신은 '배경'으로 믿고있는 것들을 통해 사각형 투자 수익 (ROI)을 선택합니다.
- 측정 (단축키 : M). 아래 참고 의미합니다.
- B. 비율에 대한 계산 임계값
- 사각형을 선택셀 (들)의 광학 평면 주변 투자 수익 (ROI).
- 측정 (단축키 : M). 아래 뜻과 표준 편차를 적어 둡니다.
- 추가로 두 번 반복 또는 당신은 '이동'을 누르면 한 번에 세 개의 상자를 그릴 수 있습니다.
- 계산 및 비율에 대한 임계값을 참고 = 세 가지의 값을 평균 (1 + SD / 평균) X 32 / 사이트를 복제합니다.
- C. 셀 모서리 임계값
- 이미지> 스택스> Z 프로젝트 ... 프로젝션 유형 선택 : '평균 강도'
- 이미지>> 임계값을 조정합니다.
- 흑백을 선택합니다.
- '아래의'정의 (어퍼 슬라이더) 제한과 해당 값 (슬라이더의 오른쪽에있는)을 내려합니다. 검은 지역에서 발생하는 이벤트만 계산됩니다.
- '리셋'을 클릭하십시오.
- 스택 (2 바로가기) Analyse
- 이 단계에서 하나의 시리즈를 선택하고 '첫 번째 파일'을 IE와 '마지막 파일은'동일해야합니다.
- 그리고 '셀 모서리 임계값', '비율에 대한 임계값'빼서에 대한 임계값 '의 값을 입력합니다. 자신의 기본값에서 기타 설정을 둡니다.
- 이 알고리즘은 처리 시리즈가 왼쪽에 표시되며 오른쪽에 원래있는 듀얼 창에서 윈도우를 생성합니다. 조심스럽게 눈으로 보이는 이벤트를, 발견되지 않은있는 잘못된 반응과 행사의 개수를 평가하기 위해 이것을 통해서 이동합니다. 칼슘 2보다 정확한 검색을 얻으려면 + 과도 그것이 약간의 '입자 매개 변수'의 일부를 조정해야 할 수도 있습니다. 프로세스가 조금 '를 클릭하고 미스'을 보이는 첫 번째 시도에서 수 있지만, 하나는 신속하게 매개 변수가 열쇠입니다 무엇으로 느낌을 가져옵니다.
- 각 시리즈의 알고리즘은 엑셀 파일을 생성하는 이벤트 감지의 세부 특성 (예 : 진폭, 면적 및 위치 등). '잘못된 반응'-이 엑셀 파일에서, 손으로, 제거할 수 있습니다 - 알고리즘 출력합니다 (예 : 8.17 단계) 그 이미지 파일을 검토하여 확인.
Discussion
형광 칼슘 2 선택 + 표시기
오레곤 그린 488 BAPTA - 1이 그것 (I)가 다른 지표 (예 : Fluo - 4 및 칼슘 그린) 1에 비해 밝은 때문에 AM은 칼슘이 같이 + 표시를 선택했다, (ii) 본 칼슘 2 생리적 변화에 민감합니다 + 농도 (3) 하중 많은 평활근 세포, 모니터로 커플링 평활근 세포를 활성화,.하는 세포내 칼슘 2 + 농도 [칼슘 2 +] 나는 (중이야의 예 : 2 deferens)와 비슷한 규모 1 K D와 함께 그러나, 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 여기는 비 ratioable 칼슘 2 + 지표이며, 등 쉽게 절대를 결정하는 데 사용할 수 없습니다 [칼슘 2 +] 나는. 또한, 그것은 또한 +있을 경우 높은 농도의 칼슘 2 버퍼와 [칼슘 2 +] 나는 높은 진폭의 변화와 포화되고 있습니다.
자발적인 수축성의 억제
평활근 기관의 자발적인 수축성이 + L - 타입 칼슘 2 일까지 + 채널 (; diltiazem 4 nifedipine 3 예가) 칼슘 2의 움직임을 차단하여 같은 pharmacologically 줄어들 수 있습니다. 이러한 약물은 크게 전체 세포 칼슘 2의 진폭 + 깜박 / 과도를 줄일됩니다.
중이야의 수축은 주로 purinergic 및 noradrenergic neurotransmission의 조합의 결과를 deferens. 이 조직에 초점 칼슘 2 + 과도 그러나, noradrenergic 수용체 봉쇄 (예 : α 1 adrenoceptor, prazosin 5) 운동은 초점 칼슘 2 + 과도 영향을주지 않고 줄일 수 수 있도록하기 위해 구별하지 않는다.
또는 수축은 wortmannin 6 마이 오신 라이트 체인 키나제 예의 억제를 통해 '하류'막을 수 있습니다.
결론
submicron 해상도에서 칼슘 2 + 형광 모니터링을하는 것은 신경 전달 물질 릴리스 5,7의 포스트 junctional 효과를 연구하고 칼슘 2 릴리스 + 내부 저장 (예 : '불꽃'8)부터 강력한 기술입니다. 방법론을 사용하여 + 과도 여기에 설명된 칼슘 2의 분석은 상업에 사용할 이미지 분석 패키지에 비해 비용 효율이고 ImageJ에 대한 사용자 지정 작성된 자바 플러그인을 통해 맞춤형 분석을 수 있습니다.
Disclosures
노력은 사용 동물의 번호와 자신의 고통을 최소화하기 위해 만들어진, 모든 실험은 영국의 동물 (과학 절차) 법 1986 유럽 이사회 지침 86/09/EEC 커뮤니티에 따라 진행되었다.
Acknowledgments
웰컴 트러스트는 재정 지원을 (JSY 및 KLB에 074,128의 연구 활동에 VIP 수상) 제공됩니다. RJA 의료 연구위원회 학생이기
Leica_SP2_Stacker, 시리즈로 '재건'에 대한 TIFFs를 가져오기 위해 사용되는 알고리즘은, Leica_tiff_sequence 그의 권한 토니 콜린스에 의해 개발 및 사용 ImageJ에 Leica SP2 TIFFs를 읽기위한 플러그인을 기반으로합니다.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg과 TurboReg은 조직의 움직임에 대한 정확한하는 데 사용되는 알고리즘은 트레이스 venaz 및 동료 (1998) 9을 기반으로합니다.
Excel_writer.jar는 커트 데 보스 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html)에 의해 작성되었습니다.
JNCT0.08JoVE.ijm, 입자 검출 알고리즘은 KL의 두뇌에 의해 제작되어 이전 5 세부 알고리즘을 기반으로합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport Corp. | M-VW-3046-OPT-012140 | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
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