Focal Ca ^{2 +} Övergående Påvisande i glatt muskulatur

Summary

Detaljer metoder för högupplösta Ca

Abstract

Ca ^{2 +-avbildning} av glatt muskulatur ger en inblick i cellulära mekanismer som inte kan resultera i förändringar av membran potential, som t.ex. frisläppandet ^av Ca2 ⁺ från interna affärer, och gör att flera celler som skall övervakas samtidigt för att bedöma till exempel koppling i syncytial vävnad. Subcellulära Ca ^{2 +} transienter är vanliga i glatt muskulatur, men är svåra att mäta exakt på grund av de problem som orsakas av deras stokastisk händelse, över en ofta brett synfält, i ett organ som det benägna att ingå avtal. För att lösa detta problem har vi utvecklat en serie avbildning protokoll och rutiner analys för att förvärva och sedan analysera, på ett automatiserat sätt, hur ofta, plats och amplitud av sådana händelser. Även om detta tillvägagångssätt kan tillämpas i andra sammanhang, innebär vårt arbete att upptäcka lokala Purinergic ^{Ca2 +} transienter för att lokalisera sändare utgivning med submicron upplösning.

ATP är utsläppt som en cotransmitter från autonoma nerver, där den binder till P2X1 receptorer på den glatta muskulaturen i detrusor och sädesledaren. Ca ^{2 +} kommer in i glatt muskulatur, vilket resulterar i Purinergic neuroeffector Ca ^{2 +} transienter (NCTS). I fokus Ca ^{2 +} transienter gör den optiska övervakningen av signalsubstansen ut på ett sätt som har många fördelar jämfört med elektrofysiologi. Bortsett från de mycket bättre rumslig upplösning, har optisk inspelning den ytterligare fördelen att inspelningen av transmittorfrisättning från många urskiljbara platser samtidigt. Dessutom är den optiska planet i fokus lättare att underhålla eller korrigera under lång inspelning serien än vad ompositionering av en intracellulär vassa mikroelektrod.

Sammanfattningsvis är en metod för avbildning av Ca ^{2 +} fluorescens anges som specificerar framställning av vävnad, och förvärvet och analys av data. Redogör vi för användning av flera skript för analys av sådana Ca ^{2 +} transienter.

Protocol

Del 1: Förberedelse av Ca ^{2 +-indikatorn} (Oregon Grön 488 BAPTA-1 AM)

1. Oregon Grön 488 BAPTA-1 levereras AM i 500 l flaskor som en liten mängd (50 g) pulver. Tillsätt 40 l Pluronic F-127 lösning till pulver, skaka försiktigt i 30 s, lägg sedan till 460 l PSS och skaka försiktigt i 30 sekunder Den slutliga lösningen ger 10 mikroM Oregon Grön 488 BAPTA-1 AM, 4 x 125 l alikvoter. Undvik exponering för ljus och förvara vid -20 C.

Del 2: Ca ^{2 +} lastning

1. Ta bort Ca ^{2 +-indikatorn} (Oregon Grön 488 BAPTA-1 AM) från (-20 C) frysen och låt den tina i rumstemperatur.
2. Tag 1 ml av PSS i ett provrör och placera i vattenbad. Bubbla med 95% O ₂ / 5% CO ₂ i en takt på omkring 1 bubbla visas per sekund. Bubbelflaskan måste säkras i provrör, t.ex. med en propp eller med Parafilm.
3. Dissekera vävnad från djur och, i en Sylgard-fodrade petriskål, försiktigt bort bindväv. Oberoende av glatt muskulatur orgel typ bör PSS bytas ut varje 10 minuter och vävnad ska tvättas väl (till exempel genom att ersätta PSS tre gånger) efter dissekering. För sädesledaren: överväga att skära orgeln längden sätt att producera ett ark med vävnad. För urinblåsan: öppna längdriktningen från blåshalsen (bakre) till toppen av kupolen (främre). Förbered fyra band, 6 - 8 mm långa och 1 - 2 mm bred, längs ryggens yta detrusor, skär i riktning mot den dominerande muskeln buntar.
4. Placera dissekerade vävnad i "förvärmda och bubblade" PSS.
5. Tillsätt 125 ìl av 10 mikroM Oregon Grön 488 BAPTA-1 AM för att de provrör och ge lite skaka, för hand, för att blanda.
6. Återuppta bubblande och lämna, täckt med folie. Klockan är tar för tillräcklig vävnad att ta upp Ca ^{2 +} indikator varierar med storleken av vävnad och tjocklek glatt muskulatur lagret. Till exempel: 70 minuter (mus detrusor, råtta anococcygeus) till 120 min (råtta detrusor, mus sädesledare).

Del 3: Förbereda "Ca ^{2 +} laddade" vävnad för mikroskopi

Noggrann fastlåsning av vävnaden är nödvändig för att minimera spontan rörelse av vävnad (en egenskap hos avbildning av glatta muskelceller från relativt intakt vävnad) och för att underlätta placeringen av en lämplig plats för avbildning (som en platt bit vävnad kan undersöktes i två dimensioner, i stället för tre).

1. Skölj vävnad i bubblade PSS i minst 5 minuter.
2. Montera i Sylgard-fodrade förberedelse maträtt, sträcker vävnad (något) för att bilda en platt ark. Undvik att använda långa "pinnar" som kan repa målet, istället använda korta längder på 25-50 ìm diameter silvertråd som "pinnar" och sätt in i vinkel.
3. Placera preparatet rätten på mikroskop scenen, var noga med att se till att PSS inte fly från Sylgard-fodrade område i skålen (eftersom detta kan leda till ett stort område som täcks av PSS, när superfusion börjar).
4. Slå på pumpen för att superfuse beredningen med PSS. En hastighet av 100 ml per timme är ofta anställda.
5. Slå på värmaren.
6. Placera in-och utflöde rör och temperaturgivare med att förbereda skålen (anbringande vardera till metallband av magneten på basen). Höjden på toppen av slutstycket kommer att avgöra djupet i PSS. Var noga med att se till att utflödet faktiskt bort PSS (som det ibland inte från början).
7. Ställ in temperaturen på värmaren att nå önskad temperatur, t ex 33-35 C.
8. Låt vävnaden komma i jämvikt i minst 10 minuter.

Del 4: Val av plats för bild

Exponering för excitation belysningen kommer photobleach indikatorn, så undvik att använda mer än några sekunder åt gången.

1. Med en låg effekt objektiv (10x eller 20x) använda epifluorescence, spännande med ett blått ljus, för att visa den glatta muskulaturen och identifiera en lämplig region att övervaka. Försök att välja en webbplats baserad på: rörelser (som bör vara minimal) och antalet glatta muskelceller i fält. Bright "strukturer" kan orsaka ett stort antal "falska positiva" i bilden upptäckt algoritm, så undviker platser med många (t.ex.) varvas epitelceller och fibroblaster.
2. Byt till en högre makt mål (40x).
3. Rotera skede eller den optiska axeln så att den glatta muskulaturen cell (er) ligger horisontellt (dvs. Parallellt med den snabbt skanna axeln).

Del 5: konfokalmikroskopi

Detaljerna i hur konfokalmikroskop är "ställa upp" är specifika för varje mikroskop typ, menviktiga överväganden är: hastighet (minst 5 Hz krävs för de flesta Ca ^{2 +} transienter), upplösning och storleken på fältet (som båda handlas-off med fart). Vissa av följande protokoll är specifik för en Leica SP2 upprätt konfokalmikroskop. En typisk protokoll är: 100 ram-serien, som förvärvades vid 5 Hz (256 x 256 bildpunkter, ca 100 x 100 ìm.) Eller 13,5 Hz (256 x 64 pixlar, ca 100 x 25 ìm.). Skanningen huvudet som att gå i båda riktningarna (för att maximera förvärv hastighet) och förvärva till 1000 Hz per rad.

1. Stäng hål till ett "luftigt disk".
2. Ställ lasern (488 nm) ström mellan 25 och 35% på AOTF, detta värde är en avvägning mellan ljusstyrka och fotoblekning. (Den sistnämnda är ett särskilt problem vid långa inspelningar.)
3. Förvärva sex serier per plats, och 4-6 platser per "behandling". Det är vanligt att sträva efter att följa samma sex platser före läkemedel (dvs. "kontroll") och efter droger, även om betydande fotoblekning kan orsaka försöksledaren att avvika från detta.
4. Det är viktigt med Ca ^{2 +} imaging att "tiden kontroller" utförs.

Del 6: Förberedelser för analys

1. Ladda ner och installera Image J från: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Hämta plattformsspecifika version, och sedan uppdatera till den senaste versionen genom att ladda ned den senaste imageJ.jar fil från http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, ersätta den gamla filen. Apple Mac-användare: om det går långsamt, se till att du använder den senaste versionen av Java Virtual Machine (JVM) tillgängliga från Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. Ladda ner Excel_writer.jar från: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html och installera i Plugins [katalog]> burk katalog.
3. Kopiera följande filer till plugins katalogen: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installera alla dessa skript genom att använda insticksprogram [Meny]> Makron> Installera ... funktion ImageJ.
4. Vi använder en Leica SP2 konfokalmikroskop, programvaran (Leica ULF) som genererar varje serie som en enda synlig "film" i mjukvaran, men sparar som enskilda ramar. Att rekonstruera bilder i serien: (i) Se till att alla de "frames" för att rekonstrueras är i en enda mapp (t.ex. "DataFolder> Tiffs"). (Ii) Välj Plugins [Meny]> Makron> Leica_SP2_Stacker. Välj rotkatalogen (t.ex. "DataFolder"). Välj önskad mapp från rullgardinsmenyn (t.ex. "Tiffs / '). Välj en utgång katalog eller skapar ett nytt (t.ex. "DataFolder> Stacks"). Manuset kommer då att rekonstruera serien från enskilda bildrutor.

Del 7: Korrigering för rörelse

Även rörelse avbildade området kan minimeras med bra fastlåsning och jämnt sträckt vävnad, något glatt muskulatur organ uppvisar spontana sammandragningar som inte kan avskaffas genom noggrann nåla ensam. Här beskriver vi användandet av en fritt tillgänglig algoritm som anpassar eller tändstickor ramar i en serie.

1. Ladda ner "StackReg" (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) och "TurboReg" (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Installera varje in i Plugins katalogen med insticksprogram> Makron> Installera ...
3. Lägg i en bunt som ska behandlas (Arkiv> Öppna ...) och sedan flytta till en ram som tydligt visar på intresse. Andra ramar kommer att anpassas till denna referensram.
4. Plugins> Staplar> StackReg. Prova var och en av de olika "Förvandlingar" (dvs. översättning, stel kropp, skalad Rotation, Affine) för att avgöra vad som är mest effektiva. (Ytterligare information: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

Del 8: Particle upptäckt algoritm

För varje "plats" avbildas kommer faktorer varierar som påverkar upptäckten av Ca ^{2 +} transienter. Genom att mäta vissa egenskaper hos varje plats ("partikel parametrar" - se nedan), är processen för upptäckt underlättas. Således för varje plats, man räknar "tröskeln för subtraheras", "tröskel för ratio" och "cellkanten tröskel".

1. Plugins [Meny]> Makron> Installera ... och välj "JNCT0.08Release.ijm".
2. Plugins [Meny]> Makron> belastning stack (genväg: l). Välj en serie och beräkna partikel parametrar:
   1. A. Tröskelvärde för subtraheras (= bakgrund)
3. Välj ett rektangulärt ROI över vad du tror är "bakgrund".
4. Mått (genväg: m). Anteckna medelvärdet.
   1. b. Beräkning av tröskel för förhållandet
5. Välj en rektangulärROI runt ett optiskt plan yta i cellen (s).
6. Mått (genväg: m). Anteckna medelvärdet och standardavvikelsen.
7. Upprepa ytterligare två gånger eller du kan rita tre boxar på en gång genom att trycka "shift".
8. Beräkna och anteckna tröskeln för ratio = (1 + SD / medelvärdet) x 32, i genomsnitt värden från de tre replikat / platser.
   1. C. Cellkanten tröskel
9. Bild> Staplar> Z-projektet ... Välj projektion typ: "genomsnittlig intensitet"
10. Bild> Justera> Tröskelvärde.
11. Välj svart och vitt.
12. Definiera "under" (övre reglaget) begränsar och anteckna motsvarande värde (till höger om reglaget). Endast händelser som inträffar i de svarta områdena kommer att räknas.
13. Klicka på "reset".
14. Analysera stackar (genväg: 2)
15. Välj bara en serie i detta skede, dvs den "första filen" och "sista filen" bör vara desamma.
16. Skriv in värden på "tröskeln för subtraheras", "tröskel för ratio" och "cellkanten tröskel". Lämna andra inställningar på standardvärden.
17. Algoritmen kommer att producera en dubbel-rutan fönster där den bearbetade serien visas till vänster och originalet till höger. Noga gå igenom detta för att bedöma hur många falska positiva och de tillfällen då evenemang, synliga med ögat, inte har upptäckts. För att få en mer korrekt detektion av ^{Ca2 +} transienter kan det vara nödvändigt att justera något några av de "partikel parametrar". Även om processen kan verka lite "hit and miss" på första försöket, får man snabbt en känsla för vad som parametrar är viktiga.
18. För varje serie, producerar den algoritm som en Excel-fil som detaljer egenskaper upptäcks händelsen (t.ex. amplitud, område och placering). "Falska positiva" - identifieras genom att granska de bildfiler som algoritmen resultat (t.ex. steg 8,17) - kan tas bort, för hand, från denna Excel-fil.

Discussion

Val av fluorescerande Ca ^{2 +-indikatorn}

Oregon Grön 488 BAPTA-1:00 valdes som Ca ^{2 +} indikator, eftersom det (i) är ljus jämfört med andra indikatorer (t.ex. Fluo-4 och Kalcium grön) ^1, (ii) är känslig för fysiologiska förändringar i Ca ^{2 +} koncentrationen med ett K _D i samma storleksordning ¹ till intracellulära Ca ^{2 +} koncentrationen [Ca ^{2 +]} i (t.ex. av sädesledare ^2), (iii) belastning många glatta muskelceller, vilket möjliggör smidig muskelcellen koppling som skall övervakas. Det är dock Oregon Grön 488 BAPTA-1 är en icke-ratioable Ca ^{2 +} indikator, och som sådan kan inte enkelt användas för att bestämma den absoluta [Ca ^{2 +]} _i. Dessutom kan det buffert även ^{Ca2 +} om den finns i höga koncentrationer och blir mättat med hög amplitud förändringar i ^{[Ca2 +]} _i.

Hämning av spontana kontraktilitet

Den spontana kontraktilitet i glatt muskulatur organ kan minskas farmakologiskt, t.ex. genom att blockera flödet av Ca ^{2 +} genom L-typ ^{Ca2 +-kanaler} (t.ex. genom att: nifedipin ^3, diltiazem ^4). Observera att dessa läkemedel avsevärt kommer att minska amplituden av helcells-Ca ^{2 +} blixtar / transienter.

Sammandragning av sädesledaren resultatet av en kombination av i första hand Purinergic och noradrenerga neurotransmissionen. Fokal ^{Ca2 +} transienter i denna vävnad är dock okänslig för noradrenerga receptor blockad (t.ex. α _1-receptorn, med prazosin ^5), så rörelse kan minskas utan att påverka centrala ^{Ca2 +} transienter.

Alternativt kan kontraktion förhindras "nedströms" genom hämning av myosin lätta kedjan kinas t.ex. genom wortmannin ^6.

Slutsatser

Övervakning av Ca ^{2 +} fluorescens vid submicron resolution är en kraftfull teknik för att studera efter Junktional effekterna av signalsubstansen frigöra ^5,7 och frisättning av Ca ^{2 +} från interna affärer (t.ex. "gnistor" ^8). Analysen av Ca ^{2 +} transienter enligt den metod som beskrivs här är kostnadseffektivt jämfört med kommersiellt tillgängliga bildanalys paket och möjliggör skräddarsydda analys genom skräddarsydda skriven Java-plugins för ImageJ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 solution	Invitrogen	P3000MP	20% solution in DMSO
Leica SP2 upright confocal microscope	Leica Microsystems
Air table (‘vibration isolated workstation’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning