Summary
Dettagli di metodi ad alta risoluzione Ca
Abstract
Ca 2 + immagini della muscolatura liscia permette di comprendere meglio i meccanismi cellulari che non possono tradursi in variazioni del potenziale di membrana, come il rilascio di Ca 2 + dai depositi interni, e permette più celle di monitorare contemporaneamente di valutare, per esempio, giunto a tessuto sinciziale. Subcellulare Ca 2 + transitori sono comuni nella muscolatura liscia, ma sono difficili da misurare con precisione a causa dei problemi causati dal loro verificarsi stocastico, spesso su un campo ampio, in un organo che è soggetta a contratto. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una serie di protocolli di imaging e di routine di analisi per acquisire e poi analizzare, in modo automatico, l'ubicazione, la frequenza e l'ampiezza di tali eventi. Se questo approccio può essere applicato in altri contesti, il nostro lavoro comporta l'individuazione di locali purinergici Ca 2 + transitori per l'individuazione di rilascio del trasmettitore con risoluzione di submicron.
ATP è rilasciato come cotransmitter da nervi autonomi, dove si lega a recettori P2X1 sulla muscolatura liscia del detrusore e vasi deferenti. Ca 2 + entra nella muscolatura liscia, con conseguente purinergici neuroeffector Ca 2 + transitori (NCTS). La focale di Ca 2 + transitori permettono il monitoraggio ottico di rilascio dei neurotrasmettitori in un modo che ha molti vantaggi rispetto elettrofisiologia. A parte la risoluzione spaziale molto migliorato, registrazione ottica ha il vantaggio aggiuntivo di permettere la registrazione di rilascio del trasmettitore da molti siti distinguibili contemporaneamente. Inoltre, il piano ottico di messa a fuoco è più facile da mantenere o correggere durante la serie lunga registrazione che è il riposizionamento di un microelettrodo intracellulare taglienti.
In sintesi, un metodo per l'imaging di Ca 2 + fluorescenza si delinea che i dettagli della preparazione del tessuto, e l'acquisizione e l'analisi dei dati. Delineiamo l'utilizzo di script diversi per l'analisi di tali Ca 2 + transitori.
Protocol
Parte 1: Preparazione del Ca 2 + indicatore (Oregon verde 488 Bapta-1 AM)
- Oregon verde 488 Bapta AM-1 arriva in 500 fiale microlitri come una piccola quantità (50 mg) di polvere. Aggiungere 40 microlitri Pluronic F-127 la soluzione alla polvere, agitando dolcemente per 30 s, quindi aggiungere 460 microlitri PSS, e agitare delicatamente per 30 s. La soluzione finale, 10 mM Oregon verde 488 Bapta-1 AM, dispone di 4 x 125 microlitri aliquote. Evitare l'esposizione alla luce e conservare a -20 C.
Parte 2: Ca 2 + carico
- Rimuovere l'indicatore di Ca 2 + (Oregon verde 488 Bapta-1 AM) dal (-20 C) freezer e lasciare scongelare a temperatura ambiente.
- Prendere 1 ml di PSS in una provetta e porre in bagnomaria. Bubble con% O 95 2 / 5% di CO 2 a una velocità di circa 1 bolla che appaiono al secondo. Il gorgogliatore ha bisogno di essere fissato alle provetta, ad esempio con un tappo o con Parafilm.
- Sezionare il tessuto dall'animale e, in un Sylgard alberato capsula di Petri, con attenzione rimuovere il tessuto connettivo. Indipendentemente dal tipo di organo muscolo liscio, PSS deve essere sostituito ogni 10 minuti e dei tessuti devono essere lavati bene (per esempio sostituendo il PSS tre volte) dissezione seguente. Per il dotto deferente: considerare l'organo di taglio lunghezza modi per produrre un foglio di tessuto. Per la vescica urinaria: aperta longitudinalmente dal collo della vescica (posteriore) alla sommità della cupola (anteriore). Preparare quattro strisce, 6 - 8 mm di lunghezza e 1 - 2 mm di larghezza, lungo la superficie dorsale del detrusore, tagliando in direzione dei fasci muscolari dominante.
- Luogo sezionato tessuto nel 'pre-riscaldato e bolle' PSS.
- Aggiungere 125 ml di 10 micron Oregon verde 488 Bapta-1 AM alla provetta e dare una piccola scossa, a mano, per mescolare.
- Riprendi bolle e lasciare, coperto con un foglio. Il tempo è necessario per il tessuto sufficiente a raccogliere la Ca 2 + indicatore varia con le dimensioni del tessuto e lo spessore dello strato di muscolatura liscia. Per esempio: 70 minuti (mouse detrusore, anococcygeus ratto) a 120 minuti (detrusore ratto, topo vas deferente).
Parte 3: Preparazione del 'Ca 2 + caricato' dei tessuti per la microscopia
Pinning attenta del tessuto è necessaria per ridurre al minimo movimento spontaneo del tessuto (una proprietà di imaging di cellule muscolari lisce dal tessuto relativamente intatto) e per facilitare la posizione di un sito idoneo per l'imaging (come un pezzo di tessuto può essere intervistati in due dimensioni, invece di tre).
- Lavare il tessuto in PSS bollito per almeno 5 minuti.
- Montare a Sylgard alberati piatto preparazione, l'allungamento dei tessuti (leggermente) per formare una lamiera piana. Evitare di utilizzare lungo 'spine', che potrebbero graffiare l'obiettivo, usare lunghezze invece brevi di 25-50 micron di diametro filo d'argento come 'pin' e inserire in un angolo.
- Posizionare il piatto preparato sul palco microscopio, facendo attenzione a garantire che il PSS non sfugge dalla Sylgard alberato zona del piatto (in quanto ciò potrebbe portare ad una vasta area è coperta di PSS, quando il superfusione comincia).
- Accendere la pompa per superfuse la preparazione con PSS. Un tasso di 100 ml per ora è spesso impiegato.
- Accendere l'apparecchio riscaldatore.
- Posizionare i tubi di afflusso e deflusso e sonda di temperatura sul piatto preparato (apposizione ciascuno per la striscia di metallo dal magnete sulla sua base). L'altezza della punta del tubo di efflusso determina la profondità del PSS. Fare attenzione per assicurare che il deflusso è in realtà la rimozione PSS (come a volte non inizialmente).
- Impostare la temperatura dell'unità di riscaldamento per raggiungere la temperatura desiderata, ad es 33-35 C.
- Lasciare che il tessuto si stabilizzi per almeno 10 minuti.
Parte 4: Selezione del sito di immagine
L'esposizione a luce di eccitazione si photobleach l'indicatore, in modo da evitare di usare per più di pochi secondi alla volta.
- Con un obiettivo a basso ingrandimento (10x o 20x) l'uso a epifluorescenza, emozionante con una luce blu, per visualizzare la muscolatura liscia e di individuare una zona adatta per il monitoraggio. Provate a prendere un sito basato su: movimento (che dovrebbe essere minima) e il numero di cellule muscolari lisce del settore. Brillante 'strutture' potrebbe causare un elevato numero di 'falsi positivi' nel algoritmo di rilevamento di immagini, in modo da evitare siti con un gran numero di (ad esempio), le cellule epiteliali intervallati o fibroblasti.
- Passa a un obiettivo di potenza superiore (40x).
- Ruotare il palco o l'asse ottico così la cellula del muscolo liscio (s) è orizzontale (cioè parallela all'asse scansione rapida).
Parte 5: microscopia confocale
I dettagli di come il microscopio confocale è 'set up' sono specifici per ogni tipo di microscopio, male considerazioni chiave sono: velocità (minimo di 5 Hz è necessario per la maggior parte transitori di Ca 2 +), la risoluzione e le dimensioni del campo (due delle quali sono negoziate-off con la velocità). Alcune delle seguente protocollo è specifico per un microscopio confocale Leica SP2 verticale. Un protocollo tipico è: 100 serie telaio, acquisita a 5 Hz (256 x 256 pixel, circa 100 x 100 micron.) O 13,5 Hz (256 x 64 pixel; circa 100 x 25 micron).. La testa di scansione impostato a muoversi in modo bidirezionale (per massimizzare la velocità di acquisizione) e di acquisire a 1000 Hz per riga.
- Chiudere il foro stenopeico ad un 'disco arioso'.
- Impostare la (488 nm) potenza del laser tra il 25 e il 35% sul AOTF, questo valore è un compromesso tra luminosità e photobleaching. (Quest'ultimo è un problema particolare durante lunghe registrazioni.)
- Acquisire sei serie per ogni sito, e 4-6 siti per 'trattamento'. E 'comune a scopo di monitorare gli stessi sei siti pre-droga (' controllo ', cioè) e post-droga, anche se photobleaching significative potrebbe causare lo sperimentatore di deviare da questa.
- E 'essenziale con Ca 2 + imaging che' controlla il tempo 'sono eseguite.
Parte 6: Preparazione per l'analisi
- Scaricare e installare J Immagine da: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Scarica la piattaforma versione specifica, e quindi aggiornare alla versione più recente scaricando l'ultimo file imageJ.jar da http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, sostituendo il vecchio file. Gli utenti Apple Mac: se si fa girare lentamente, assicurarsi di utilizzare l'ultima versione della Java Virtual Machine (JVM) disponibili da Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
- Scarica Excel_writer.jar da: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e installare il plug-in [directory] jar> directory.
- Copiare i seguenti file nella cartella Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installare ognuno di questi script utilizzando il plugin [Menu]> Macro> Installa ... funzione di ImageJ.
- Usiamo un microscopio confocale Leica SP2, il software (Leica LCS) per la quale genera ogni serie come un unico visibile 'film' all'interno del software, ma consente di risparmiare come singoli fotogrammi. Per ricostruire fotogrammi in serie: (i) Assicurarsi che tutti i 'fotogrammi' essere ricostruito in una singola cartella (ad esempio 'DataFolder> TIFF'). (Ii) Selezionare Plugin [Menu]> Macro> Leica_SP2_Stacker. Selezionare la directory radice (ad esempio 'DataFolder'). Selezionare la cartella desiderata dal menu a tendina (ad esempio 'TIFF /'). Selezionare una directory di output o generare una nuova ('DataFolder> Stack', ad esempio). Lo script sarà poi ricostruire serie di singoli fotogrammi.
Parte 7: Correzione per il movimento
Anche se il movimento del sito ripreso può essere minimizzato con una buona pinning e tessuti in modo uniforme-allungato, alcuni organi muscolari lisce presentano contrazioni spontanee che non può essere abolito da un'attenta pinning da solo. Qui si descrive l'uso di un algoritmo liberamente disponibile che si allinea o partite frame all'interno di una serie.
- Download 'StackReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) e 'TurboReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
- Installare ogni plugin nella directory usando il Plugin> Macro> Installa ...
- Caricare una risma da elaborare (File> Apri ...) e poi passare a un fotogramma che mostra chiaramente il campo di interesse. Altri fotogrammi sarà allineato a questo sistema di riferimento.
- Plugins> Stack> StackReg. Provare a ciascuno dei diversi 'Trasformazioni' (Traduzione cioè, corpo rigido, in scala di rotazione, affine) per determinare ciò che è più efficace. (Ulteriori dettagli: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Parte 8: algoritmo di rilevamento delle particelle
Per ogni 'sito' ripreso, i fattori di varia che influenzano la rilevazione di Ca 2 + transitori. Misurando alcune proprietà di ciascun sito ('parametri delle particelle' - sotto dettagliato), il processo di rilevazione è facilitato. Così per ogni sito, si calcola 'soglia per sottratta' 'soglia per il rapporto', e 'la soglia limite di cella'.
- Plugin [Menu]> Macro> Installa ... e selezionare 'JNCT0.08Release.ijm'.
- Plugin [Menu]> Macro> pila di carico (scorciatoia: l). Selezionare una serie e calcolare i parametri delle particelle:
- a. Soglia per la sottratto (sfondo =)
- Selezionare un ROI rettangolare su ciò che si crede di essere 'background'.
- Misura (scorciatoia: m). Annotare MEDIA.
- b. Soglia di calcolo per il rapporto
- Selezionare una forma rettangolareROI intorno ad una zona otticamente piatto della cella (s).
- Misura (scorciatoia: m). Nota DEVIAZIONE giù media e standard.
- Ripetere altre due volte o è possibile disegnare tre caselle in una sola volta premendo 'turno'.
- Calcolare e annotare la soglia per il rapporto = (1 + SD / media) x 32, con una media dei valori delle tre replicazione / siti.
- c. Cellula bordo Soglia
- Immagine> Pile> Z progetto ... Scegli il tipo di proiezione: 'intensità media'
- Immagine> Regolazioni> Soglia.
- Seleziona bianco e nero.
- Definire 'sotto' (cursore superiore) limite e annotare il valore corrispondente (a destra del cursore). Solo gli eventi che si verificano nelle regioni nero saranno conteggiati.
- Fare clic su 'reset'.
- Analizzare le pile (scorciatoia: 2)
- Selezionare una sola serie in questa fase, cioè il 'primo file' e 'ultimo file' dovrebbe essere la stessa.
- Immettere i valori di 'soglia per sottratta' 'soglia per il rapporto', e 'la soglia limite di cella'. Lasciare le altre impostazioni ai loro valori di default.
- L'algoritmo produce un doppio vetro di una finestra in cui viene mostrata la serie di trattati sulla sinistra e l'originale sulla destra. Attentamente passare attraverso questo per valutare il numero di falsi positivi e le occasioni in cui gli eventi, visibile ad occhio, non sono stati rilevati. Per ottenere una maggiore accuratezza nel rilevamento di Ca 2 + transitori può essere necessario modificare leggermente alcuni 'parametri delle particelle'. Mentre il processo può sembrare un po 'colpo di fortuna' al primo tentativo, si ha subito una sensazione di ciò che i parametri sono fondamentali.
- Per ogni serie, l'algoritmo produce un file di Excel che le caratteristiche particolari della manifestazione rilevato (come ampiezza, area e posizione). 'Falsi positivi' - identificato esaminando i file di immagine che le uscite algoritmo (ad esempio, passo 8.17) - possono essere rimosse, a mano, da questo file di Excel.
Discussion
Scelta di fluorescente Ca 2 + indicatore
Oregon verde 488 Bapta-1 AM è stata scelta come indicatore di Ca 2 + perché (i) è brillante rispetto ad altri indicatori (ad esempio Fluo-4 e Green calcio) 1, (ii) è sensibile ai cambiamenti fisiologici nella concentrazione Ca 2 + con una K d di grandezza simile 1 al intracellulare di Ca 2 + concentrazione [Ca 2 +] i (es. vasi deferenti 2), (iii) i carichi molte cellule muscolari lisce, consentendo cellule della muscolatura liscia accoppiamento da monitorare. Tuttavia, Oregon verde 488 Bapta-1 AM è un non-ratioable Ca 2 + indicatore, e come tale non può essere facilmente utilizzato per determinare l'assoluto [Ca 2 +] i. Inoltre, può anche buffer di Ca 2 + se sono presenti in concentrazioni elevate e si satura con i cambiamenti di ampiezza elevata [Ca 2 +] i.
L'inibizione della contrattilità spontaneo
La contrattilità spontaneo degli organi muscolo liscio può essere ridotta farmacologicamente, come ad esempio bloccando il movimento di Ca 2 + attraverso la L-type Ca 2 + canali (ad esempio: nifedipina 3; diltiazem 4). Si noti che questi farmaci ridurrà di molto l'ampiezza delle cellule intere Ca 2 + flash / transitori.
Contrazione dei vasi deferenti risultati da una combinazione di neurotrasmissione principalmente purinergici e noradrenergico. Focali transitori Ca 2 + in questo tessuto sono, tuttavia, insensibili al blocco dei recettori noradrenergici (ad esempio α 1 adrenergico, da prazosina 5) in modo movimento può essere ridotto senza compromettere focale Ca 2 + transitori.
In alternativa, la contrazione può essere prevenuto 'a valle' attraverso l'inibizione della chinasi della catena leggera ad esempio miosina da wortmannina 6.
Conclusioni
Monitoraggio Ca 2 + di fluorescenza a risoluzione di submicron è una tecnica potente per lo studio post-giunzionale effetti rilascio di neurotrasmettitore 5,7 e il rilascio di Ca 2 + dai depositi interni (ad esempio 'scintille' 8). L'analisi di Ca 2 + transitori utilizzando il metodo descritto qui è costo-efficace rispetto ai pacchetti di immagini disponibile in commercio e permette l'analisi su misura attraverso l'analisi personalizzata scritta plugin Java per ImageJ.
Disclosures
Si è cercato di minimizzare il numero di animali usati e la loro sofferenza; tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con gli animali nel Regno Unito (Scientific Procedure) Act del 1986 e delle Comunità europee la direttiva del Consiglio 86/09/EEC.
Acknowledgments
La Wellcome Trust ha fornito sostegno finanziario (Premio VIP per JSY e 074128 Research Fellowship a KLB). Medical Research Council Studentship a RJA
Leica_SP2_Stacker, un algoritmo utilizzato per importare TIFF per la 'ricostruzione' in una serie, si basa su Leica_tiff_sequence, un plugin per leggere Leica TIFF SP2 in ImageJ, sviluppato da Tony Collins e utilizzato con il suo permesso.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg e TurboReg, gli algoritmi usati per correggere il movimento del tessuto, si basano su Th venaz e colleghi (1998) 9.
Excel_writer.jar è stata scritta da Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, l'algoritmo di rilevamento delle particelle, si basa su un algoritmo scritto da Brain KL e dettagliata in precedenza 5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport Corp. | M-VW-3046-OPT-012140 | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
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