Фокусное Ca ^{2 +} Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре

Summary

Подробнее методы высокого разрешения Ca

Abstract

Са ^{2 +} визуализации гладких мышц обеспечивает понимание клеточных механизмов, которые не могут привести к изменениям мембранного потенциала, таких, как освобождение Са ^{2 +} из внутренних магазинах, а также позволяет несколько ячеек для мониторинга одновременно оценить, например, в связи синцитиальный ткани. Субклеточных Са ^{2 +} переходных распространены в гладкой мускулатуре, но трудно точно измерить из-за проблем, вызванных их возникновения стохастических, более часто широкое поле зрения, в орган, который она склонна к контракту. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали серию изображений протоколов и анализ процедур по приобретению и затем проанализировать, в автоматическом режиме, частоты, амплитуды и местоположение таких событий. Хотя такой подход может быть применен и в других контекстах, наша собственная работа включает в себя обнаружение локальных purinergic Са ^{2 +} переходные для размещения передатчика релиз с резолюцией субмикронных.

АТФ высвобождается в виде cotransmitter от вегетативных нервов, где он связывается с рецепторами на P2X1 гладкой мускулатуры детрузора и семявыносящих протоков. Са ^{2 +} входит гладких мышц, в результате чего purinergic neuroeffector Са ^{2 +} переходные (NCTS). Координационным Са ^{2 +} переходных позволяют оптического мониторинга нейромедиатора выпуска таким образом, что имеет много преимуществ по сравнению с электрофизиологии. Помимо значительно улучшить пространственное разрешение, оптической записи имеет дополнительное преимущество, что позволяет запись передатчик освобождение от многих различимы сайтов одновременно. Кроме того, оптические плоскости фокуса легче поддерживать или исправить в течение длинного ряда записи, чем это репозиционирование внутриклеточных резкое микроэлектрода.

Таким образом, метод для работы с изображениями Са ^{2 +} флуоресценции в котором подробно изложил подготовки ткани, а также приобретение и анализ данных. Мы выделяем использованием нескольких сценариев для анализа таких Са ^{2 +} переходных процессов.

Protocol

Часть 1: Подготовка Са ^{2 +} индикатор (Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 AM)

1. Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 утра прибывает в 500 мкл флаконах, как небольшое количество (50 мкг) порошка. Добавить 40 мкл Pluronic F-127 решение порошок, пожимая мягко в течение 30 секунд, затем добавьте 460 мкл PSS, и встряхнуть мягко в течение 30 с Окончательное решение, 10 мкМ Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 AM, имеет 4 х 125 мкл аликвоты. Избегайте воздействия света и хранить при температуре -20 С.

Часть 2: Ca ^{2 +} погрузка

1. Удалить Са ^{2 +} индикатор (Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 AM) от (-20 С), морозильник и позволяют таять при комнатной температуре.
2. Принимать по 1 мл PSS в пробирки и поместите в водяной бане. Пузырь с 95% O ₂ / 5% CO ₂ в размере около 1 пузыря появляются в секунду. Фонтанчик для питья должна быть надежно закреплены в пробирке, например, с пробкой или с парафильмом.
3. Рассекать ткани животных и, в Sylgard подкладке чашке Петри, осторожно удалите соединительную ткань. Независимо от типа органа гладкие мышцы, PSS следует менять каждые 10 минут и ткани должны быть вымыты хорошо (например, заменив PSS три раза) после вскрытия. Для семявыносящих протоков: рассмотреть вопрос о сокращении органов длины способов производства листа ткани. Для мочевого пузыря: открытое продольно от шейки мочевого пузыря (задний) на вершину купола (передние). Подготовьте четыре полосы, 6 - 8 мм в длину и 1 - 2 мм, вдоль спинной поверхности детрузора, резка в направлении доминирующих мышечных пучков.
4. Место расчлененный ткани в 'подогретого и клокотало "PSS.
5. Добавить 125 мкл 10 мкМ Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 утра до пробирку и дать немного трясти, от руки, перемешать.
6. Резюме бурлит и уйти, покрытой фольгой. Время необходимое для достаточного ткани занять Са ^{2 +} показатель варьируется в зависимости от размера ткани и толщина слоя гладкой мускулатуры. Например: 70 минут (мышь детрузора, крыса anococcygeus) до 120 минут (крыса детрузора, мышь семявыносящих протоков).

Часть 3: Подготовка "Са ^{2 +} загружаемые" ткани для микроскопии

Тщательное закрепление ткани необходимо для того, чтобы свести к минимуму стихийное движение ткани (свойство изображений гладкомышечных клеток от относительно неповрежденной ткани), а также для облегчения расположения подходящее место для работы с изображениями (как плоский кусок ткани может быть опрошенных в двух измерениях, а не три).

1. Промойте ткань в пузырилась PSS, по крайней мере 5 минут.
2. Горы в Sylgard подкладке подготовки блюдо, растяжение тканей (немного), чтобы сформировать плоский лист. Старайтесь не использовать длинные "контакты", которые могут поцарапать цели; использовать вместо коротких отрезков 25-50 мкм серебряной проволоки диаметром как "контакты" и вставьте под углом.
3. Позиция подготовки блюдо на столике микроскопа, соблюдая осторожность, чтобы гарантировать, что PSS не уйти от Sylgard подкладке области блюдо (как это может привести к большой площади покрываются в PSS, когда начинается superfusion).
4. Включите насос, чтобы переливать препарат с PSS. Скоростью 100 мл в час часто используется.
5. Включите нагреватель блока.
6. Место притока и оттока трубы и датчик температуры на подготовку блюдо (прикрепление каждого к металлической полосы магнитом на его основе). Высота кончик трубки отток будет определять глубину PSS. Будьте осторожны, чтобы гарантировать, что отток на самом деле удаления PSS (как это иногда не на начальном этапе).
7. Установите температуру нагревателя на единицу для достижения желаемой температуры, например, 33-35 С.
8. Разрешить ткани, чтобы уравновесить, по крайней мере 10 мин.

Часть 4: Выбор сайта для изображения

Воздействие возбуждения освещение будет photobleach индикатора, поэтому избегайте использовать более нескольких секунд за раз.

1. При низкой цели власти (10x или 20x) используют epifluorescence, захватывающие с синим светом, чтобы посмотреть в гладких мышц и определить подходящий регион для мониторинга. Старайтесь подбирать для сайта на основе: движение (которое должно быть минимальным) и количество гладкомышечных клеток в поле. "Структуры" Яркий может вызвать большое количество "ложных срабатываний" в алгоритме определения изображения, поэтому следует избегать сайты с большим количеством (например) перемежаются эпителиальных клеток или фибробластов.
2. Переключить на высшую силу объективных (40x).
3. Поворот сцене или оптической оси так гладко мышечных клеток (ы) лежит горизонтальная (т.е. параллельно оси быстрого сканирования).

Часть 5: конфокальной микроскопии

Подробности того, как конфокальной микроскопии является 'создать' специфичны для каждого микроскопа типа, ноосновные соображения являются: скорость (не менее 5 Гц требуется для большинства Са ^{2 +} переходные процессы); разрешение и размер поля (оба из которых торгуются-офф со скоростью). Некоторые из этих протоколов, характерные для Leica SP2 вертикально конфокальной микроскопии. Типичный протокол: 100 кадров серии, приобретенных на 5 Гц (256 х 256 пикселей; примерно 100 х 100 мкм.) Или 13,5 Гц (256 х 64 пикселей; примерно 100 х 25 мкм.). Сканирующей головки должны будут переехать двунаправленным (максимально приобретения скорости) и приобрести на частоте 1000 Гц в строке.

1. Закрыть отверстие, чтобы один "Эйри.
2. Установить лазер (488 нм) мощностью от 25 до 35% на AOTF; это значение компромисс между яркостью и фотообесцвечивания. (Последняя особых проблем в течение долгих записей.)
3. Приобретать шесть серий на сайте, и четыре - шесть сайтов на «лечение». Как правило стремиться контролировать те же шесть сайтов предварительно препарат («контроль» то есть) и после наркотиков, несмотря на значительные фотообесцвечивания может привести к экспериментатору отойти от этого.
4. Очень важно, с Са ^{2 +} изображения, что "время управления" выполняются.

Часть 6: Подготовка к анализу

1. Скачайте и установите изображение J от: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Скачать платформы версии, а затем обновить до последней версии, загрузив последнюю imageJ.jar файл из http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, заменив старый файл. Apple Mac пользователей: если он работает медленно, убедитесь, что вы используете последнюю версию Java Virtual Machine (JVM), имеющихся в Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. Скачать Excel_writer.jar от: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html и установить в Плагины [каталог]> банку каталог.
3. Скопируйте следующие файлы в директорию Плагины: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Установите каждый из этих сценариев с помощью плагинов [Menu]> Макрос> Установить ... функция ImageJ.
4. Мы используем Leica SP2 конфокальной микроскопии, программное обеспечение (Leica LCS), для которого создается каждая серия как единый просмотра "кино" в программном обеспечении, но сохраняет в виде отдельных кадров. Для восстановления кадров в серии: (я) Убедитесь, что все 'кадры', подлежащие реконструкции в отдельную папку (например, «DataFolder> ссоры»). (II) Выберите Плагины [Menu]> Макрос> Leica_SP2_Stacker. Выберите корневой каталог (например, «DataFolder '). Выберите нужную папку из выпадающего списка ('ссоры /', например). Выберите выходной каталог или создать новую ("DataFolder> Стеки», например). Сценарий будет реконструировать ряд из отдельных кадров.

Часть 7: Исправление для движения

Хотя движение отображаемого сайта не может быть сведено к минимуму с хорошей фиксации и равномерно растягивается ткань, некоторые гладкие мышцы органов проявлять спонтанные сокращения, которые не могут быть отменены тщательной фиксации в одиночку. Здесь мы опишем использование свободно доступен алгоритм, который выравнивает или спички кадров в одной серии.

1. Скачать 'StackReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) и «TurboReg '(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Установите каждый в каталоге с помощью плагинов Плагины> Макрос> Установка ...
3. Загрузите стопку, подлежащих обработке (File> Open ...), а затем перейти на кадр, который ясно показывает, область интересов. Другие кадры будут выровнены по этой системе отсчета.
4. Плагины> Стеки> StackReg. Попробуйте каждый из различных «Преобразования» (то есть перевод, твердого тела, масштабируемый вращения, Аффинные), чтобы определить, что является наиболее эффективным. (Более подробная информация: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

Часть 8: алгоритм обнаружения частиц

Для каждого "сайт" отображаемого, факторов будет меняться, влияющие на обнаружение Са ^{2 +} переходных процессов. Измеряя некоторые свойства каждого сайта ("частица параметров - подробно изложено ниже), процесс обнаружения с их стороны. Таким образом, для каждого сайта, рассчитывается "порог вычитается», «порог отношения 'и' края ячейки порога».

1. Плагины [Menu]> Макрос> Установка ... и выберите пункт "JNCT0.08Release.ijm.
2. Плагины [Menu]> Макрос> нагрузке стека (клавиш: л). Выберите серию и рассчитать параметры частиц:
   1. a. Порог для вычитается (= фоне)
3. Выберите прямоугольной ROI над тем, что вы считаете "фоновых".
4. Мера (горячая клавиша: м). Запишите в виду.
   1. b. Расчет порога отношения
5. Выберите прямоугольныеROI вокруг оптически квартира площадью ячейки (ячеек).
6. Мера (горячая клавиша: м). Запишите среднее и стандартное отклонение.
7. Повторить еще два раза, или вы можете сделать три коробки сразу, нажав "сдвиг".
8. Рассчитайте и запишите порог соотношение = (1 + SD / среднее) х 32, в среднем значения из трех повторяет / объектам.
   1. c. Порог сотовый край
9. Image> Стеки> Z проекта ... Выберите тип проекции: "Средняя интенсивность»
10. Image> Adjust> Threshold.
11. Выберите черный и белый.
12. Определить "в разделе" (верхний ползунок) предел и запишите соответствующее значение (справа от ползунка). Только события, происходящие в черном регионах будет.
13. Нажмите кнопку «перезагрузки».
14. Анализ стеки (горячая клавиша: 2)
15. Выберите только одну серию на этом этапе, то есть "первый файл" и "последний файл" должны быть одинаковыми.
16. Введите значения "Порог вычитается», «порог отношения 'и' края ячейки порога». Оставьте остальные настройки на значения по умолчанию.
17. Алгоритм будет производить двойное стекло окна, в котором обрабатываются серии показан слева, а оригинал на право. Осторожно пройти через это оценить количество ложных срабатываний и случаи, когда события, видимых на глаз, не были обнаружены. Чтобы получить более точное обнаружение Са ^{2 +} переходных это может быть необходимо отрегулировать слегка некоторые "частицы параметров. Хотя процесс может показаться немного "проб и ошибок" с первой попытки, один быстро попадает чувствовать, как к тому, что параметры являются ключевыми.
18. Для каждой серии, алгоритм выдает Excel файл, который подробно характеристики обнаруженных событий (таких как амплитуда, площадь и положение). "Ложное срабатывание" - определены путем анализа файлов изображений, алгоритм выхода (например, шаг 8.17) - могут быть удалены, от руки, из этого файла Excel.

Discussion

Выбор флуоресцентных Са ^{2 +} индикатор

Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 утра был выбран в качестве Са ^{2 +} индикатор, поскольку он (я) является яркой по сравнению с другими показателями (например, Fluo-4 и кальция зеленый) ^1, (II) является чувствительным к физиологическим изменениям в концентрации Са ^{2 +} с К _г такого же масштаба ¹ к внутриклеточной концентрации Са ^{2 +} [Са ^{2 +]} я (например, семявыносящих протоков ^2); (III) загружает много гладких мышечных клеток, что позволяет гладко мышечных клеток связи для мониторинга. Тем не менее, Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 АМ без ratioable Са ^{2 +} индикатор, и как таковые не могут быть легко использованы для определения абсолютных [Са ^{2 +]} _я. Кроме того, она может также буфера Са ^{2 +} при наличии в высоких концентрациях и насыщается высокими изменения амплитуды [Ca ^{2 +]} _я.

Подавление спонтанной сократительной

Спонтанной сократительной способности гладких мышц органов может быть уменьшена фармакологически, таких как, блокируя движение Са ^{2 +} через L-типа Ca ^{2 +-каналов} (например, путем: нифедипин ^3; дилтиазем ^4). Обратите внимание, что эти препараты значительно уменьшит амплитуду цельноклеточная Са ^{2 +} вспышек / переходных процессов.

Сокращение семявыносящих протоков результатом сочетания в первую очередь purinergic и норадренергической нейротрансмиссии. Фокусное Са ^{2 +} переходных процессов в этой ткани, однако, нечувствительны к норадренергической блокада рецепторов (например, α ₁ адренорецепторов, по празозин ^5), так что движение может быть уменьшена без изменения координационного Са ^{2 +} переходных процессов.

Кроме того, сокращение может быть предотвращено "вниз" через ингибирование миозина света, например, цепочку киназы вортманнином ^6.

Выводы

Мониторинг Са ^{2 +} флуоресценции при субмикронного разрешения мощную технику для изучения после соединительного эффекты нейромедиатора релиз ^5,7 и выпуск Са ^{2 +} из внутренних магазинах (например, «искры» ^8). Анализ Са ^{2 +} переходных использованием методологии, изложенной здесь является экономически эффективным по сравнению с коммерчески доступных пакетов анализа изображений и позволяет индивидуальные анализа с помощью специально написанный плагин Java для ImageJ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 solution	Invitrogen	P3000MP	20% solution in DMSO
Leica SP2 upright confocal microscope	Leica Microsystems
Air table (‘vibration isolated workstation’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning