Focal Ca ^{2 +} Detección de transitorios en el músculo liso

Summary

Detalles de los métodos de alta resolución de Ca

Abstract

Ca ^{2 +} imágenes del músculo liso proporciona información sobre los mecanismos celulares que no pueden dar lugar a cambios del potencial de membrana, tales como la liberación de Ca ^{2 +} de los almacenes internos, y permite a las células múltiples a controlar al mismo tiempo para evaluar, por ejemplo, el acoplamiento en tejido sincitial. Subcelular Ca ^{2 +} transitorios son comunes en el músculo liso, sin embargo, son difíciles de medir con precisión la causa de los problemas causados ​​por su aparición estocástica, sobre un campo amplio de visión con frecuencia, en un órgano que lo hace propenso a contrato. Para superar este problema, hemos desarrollado una serie de protocolos y rutinas de análisis de imágenes para adquirir y analizar, de forma automatizada, la frecuencia, ubicación y amplitud de tales eventos. Si bien este método puede ser aplicado en otros contextos, nuestro trabajo consiste en detectar los locales de Ca ^{2 +} purinérgicos transitorios para la localización de la liberación del transmisor, con resolución sub-micrométricas.

ATP se libera como cotransmitter de los nervios autonómicos, donde se une a los receptores P2X1 en el músculo liso del detrusor y los vasos deferentes. Ca ^{2 +} entra en el músculo liso, resultando en purinérgicos neuroefectoras Ca ^{2 +} transitorios (NCTS). El centro de Ca ^{2 +} transitorios permite la monitorización óptica de la liberación de neurotransmisores de una manera que tiene muchas ventajas sobre la electrofisiología. Aparte de la resolución espacial mejorado en gran medida, de grabación óptica tiene la ventaja adicional de permitir la grabación de la liberación del transmisor de muchos sitios de distinguir de forma simultánea. Además, el plano óptico de enfoque es más fácil de mantener o corregir durante la grabación de series de tiempo es el reposicionamiento de un microelectrodo intracelular aguda.

En resumen, un método para obtener imágenes de Ca ^{2 +} de fluorescencia se describe que los detalles de la preparación del tejido, y la adquisición y análisis de datos. Planteamos el uso de varios guiones para el análisis de tales Ca ^{2 +} transitorios.

Protocol

Parte 1: Preparación de la Ca ^{2 +} indicador (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM)

1. Oregon Green 488 BAPTA-1 AM se presenta en frascos de 500 l como una pequeña cantidad (50 g) de polvo. Añadir 40 l Pluronic F-127 solución para el polvo, agitando suavemente durante 30 s, a continuación, añadir 460 l PSS, y agite suavemente durante 30 s. La solución final, 10 M Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, dispone de 4 x 125 alícuotas. Evite la exposición a la luz y almacenar a -20 º C.

Parte 2: Ca ^{2 +} carga

1. Quitar el indicador de Ca ^{2 +} (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) del congelador (-20 ° C) y dejar descongelar a temperatura ambiente.
2. Tomar 1 ml de PSS en un tubo de ensayo y coloque en baño de María. Burbuja con 95% O ₂ / 5% CO ₂ a una velocidad de alrededor de una burbuja que aparece por segundo. El burbujeador debe ser asegurado en el tubo de ensayo, por ejemplo, con un tapón o con Parafilm.
3. Disecar el tejido del animal y, en una placa de Petri Sylgard forrados, retire con cuidado el tejido conectivo. Independientemente del tipo de músculo liso de órganos, PSS debe ser reemplazado cada 10 minutos y los tejidos deben ser bien lavadas (por ejemplo, mediante la sustitución de la PSS tres veces) la disección siguiente. Para los conductos deferentes: considere cortar el órgano de longitud maneras de producir una capa de tejido. De la vejiga urinaria, se abre longitudinalmente desde el cuello de la vejiga (posterior) de la parte superior de la cúpula (anterior). Prepare cuatro tiras, 6 - 8 mm de largo y 1 a 2 mm de ancho, a lo largo de la superficie dorsal del detrusor, el corte en la dirección de los haces musculares dominantes.
4. Lugar en la disección de tejidos pre-calentado y burbujas 'PSS.
5. Añadir 125 l de 10 mM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM para el tubo de ensayo y darle una pequeña sacudida, a mano, mezclar.
6. Reanudar burbujas y se van, cubierto con papel aluminio. El tiempo que tarda para el tejido suficiente para asumir el Ca ^{2 +} indicador varía según el tamaño del tejido y el espesor de la capa de músculo liso. Por ejemplo: 70 minutos (ratón detrusor, anococcygeus rata) a 120 minutos (detrusor rata, conducto deferente de ratón).

Parte 3: Preparación de la 'Ca ^{2 +} cargado' de tejidos para microscopia

Cuidado de fijación del tejido es necesario con el fin de minimizar el movimiento espontáneo de los tejidos (propiedad de las imágenes de las células del músculo liso del tejido relativamente intacto) y para facilitar la localización de un lugar adecuado para la imagen (como un pedazo de tejido puede ser encuestados en dos dimensiones, en lugar de tres).

1. Enjuague el tejido en el PSS burbujas durante al menos 5 minutos.
2. Montar en un plato de preparación Sylgard forrado, que se extiende el tejido (un poco) para formar una lámina plana. Evite el uso de largo plazo "pasadores" que puedan rayar el objetivo, el uso de longitudes cortas en vez de 25 a 50 micras de plata de alambre de diámetro como 'pasadores' e insertar en un ángulo.
3. Coloque el plato de preparación en la platina del microscopio, con cuidado para asegurarse de que la PSS no se escapa de la zona Sylgard revestidos de la antena (ya que esto puede conducir a una gran superficie que se cubre en el PSS, cuando el superfusión comienza).
4. Encienda la bomba con el fin de superfuse la preparación con PSS. A razón de 100 ml por hora se emplea a menudo.
5. Encender el aparato calefactor.
6. Coloque los tubos de entrada y salida y la sonda de temperatura en el plato preparado (colocación de cada uno para la banda de metal por el imán en su base). La altura de la punta del tubo de salida se determinará la profundidad de la PSS. Tenga cuidado para asegurarse de que la salida es en realidad la eliminación de PSS (ya que a veces no al principio).
7. Ajuste la temperatura en la unidad de calefacción para alcanzar la temperatura deseada, por ejemplo, 33 a 35 C.
8. Permitir que el tejido en reposo durante al menos 10 minutos.

Parte 4: Selección del sitio de la imagen

La exposición a la luz de excitación se photobleach el indicador, por lo que evitar el uso de más de unos pocos segundos a la vez.

1. Con un objetivo de baja potencia (10x o 20x) el uso de epifluorescencia emocionante, con una luz azul, para ver el músculo liso e identificar una región adecuada para controlar. Trate de elegir un sitio basado en: el movimiento (que debe ser mínimo) y el número de células del músculo liso en el campo. "Estructuras" brillantes pueden causar un alto número de "falsos positivos" en el algoritmo de detección de imágenes, así que evite lugares con un gran número de (por ejemplo) intercalados células epiteliales o los fibroblastos.
2. Cambiar a un objetivo de mayor potencia (40x).
3. Gire el escenario o el eje óptico por lo que la célula del músculo liso (s) se encuentra horizontal (es decir, paralelo al eje de exploración rápida).

Parte 5: La microscopía confocal

Los detalles de cómo el microscopio confocal es 'crear' son específicos para cada tipo de microscopio, perolas consideraciones más importantes son: velocidad (mínimo de 5 Hz se requiere para la mayoría de los transitorios de Ca ^{2 +),} la resolución y el tamaño de campo (dos de los cuales son objeto de comercio-off con la velocidad). Algunos de los siguiente protocolo es específico de un microscopio confocal Leica SP2 en posición vertical. Un protocolo típico es: 100 series cuadro, adquirido a 5 Hz (256 x 256 píxeles, aproximadamente 100 x 100 micras.) O 13,5 Hz (256 x 64 píxeles, unos 100 x 25 m.). La cabeza de lectura conjunto para mover de forma bidireccional (para maximizar la velocidad de adquisición) y adquirir a 1000 Hz en cada línea.

1. Cerrar el agujero de un "disco de Airy.
2. Ajuste el láser (488 nm) de energía entre un 25 y un 35% en el AOTF, este valor es un trade-off entre el brillo y photobleaching. (Este último es un problema particular durante grabaciones de larga duración).
3. Adquisición de seis series por cada sitio, y desde cuatro hasta seis sitios por "tratamiento". Es común la intención de observar los mismos seis sitios pre-droga ("control" es decir) y después de las drogas, a pesar de photobleaching significativas puede provocar que el experimentador se apartan de esto.
4. Es esencial con Ca ^{2 +} de imágenes que "los controles de tiempo" se llevan a cabo.

Parte 6: Preparación para el análisis

1. Descargue e instale el J Imagen de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Descargue la versión específica de la plataforma, y ​​luego actualizar a la última versión descargando el último archivo de imageJ.jar de http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, sustituyendo el viejo archivo. Los usuarios de Apple Mac: si se ejecuta lentamente, asegúrese de estar usando la última versión de la máquina virtual de Java (JVM), disponible en Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. Descargar Excel_writer.jar de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e instalar plugins en el [directorio] directorio jar>.
3. Copie los siguientes archivos en el directorio Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Instalar cada una de estas secuencias de comandos con los plugins [Menú]> Macros> Instalar ... en función de ImageJ.
4. Nosotros usamos un microscopio confocal Leica SP2, el software (Leica LCS) para los que genera cada serie como un único visible "película" en el software, pero guarda como cuadros individuales. Para reconstruir los marcos en la serie: (i) Asegúrese de que todos los "marcos" para ser reconstruido en una sola carpeta (por ejemplo, "DataFolder> Tiffs '). (Ii) Seleccionar Plugins [Menú]> Macros> Leica_SP2_Stacker. Seleccione el directorio raíz (por ejemplo, "DataFolder '). Seleccione la carpeta que desee en la lista desplegable ("Tiffs / 'por ejemplo). Seleccione un directorio de salida o generar una nueva ("DataFolder> Pilas", por ejemplo). La secuencia de comandos a reconstruir la serie de imágenes individuales.

Parte 7: Corrección para el movimiento

Aunque el movimiento de las imágenes del sitio pueden minimizarse con una buena fijación y el tejido uniformemente extendido, algunos órganos del músculo liso presentan contracciones espontáneas que no puede ser abolida por cuidado depositadas en paz. A continuación se describe el uso de un algoritmo de libre disposición que se alinea o partidos marcos dentro de una serie.

1. Download 'StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) y' TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Instalar cada uno en el directorio de plugins usando los plug-ins> Macros> Instalar ...
3. Cargue una pila para ser procesado (Archivo> Abrir ...) y luego pasar a un marco que muestra claramente el campo de interés. Otros marcos se alinearán con este marco de referencia.
4. Plugins> Pilas> StackReg. Intente cada uno de los diferentes "transformaciones" (es decir, traducción, cuerpo rígido, rotación escalado, afines) para determinar lo que es más eficaz. (Más detalles: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

Parte 8: algoritmo de detección de partículas

Para cada "sitio" imágenes, los factores variarán que afectan a la detección de Ca ^{2 +} transitorios. Mediante la medición de ciertas propiedades de cada sitio (los "parámetros de partículas" - se detalla a continuación), el proceso de detección es más sencilla. Así, por cada sitio, se calcula "umbral de restar", "el umbral para la relación" y "umbral borde de la celda.

1. Plugins [Menú]> Macros> Instalar ... y seleccione 'JNCT0.08Release.ijm.
2. Plugins [Menú]> Macros> pila de carga (acceso directo: l). Seleccionar una serie y calcular los parámetros de las partículas:
   1. a. Umbral para la resta (fondo =)
3. Seleccione un ROI rectangular sobre lo que usted cree que es "de fondo".
4. Medida (acceso directo: m). Tome nota de media.
   1. b. Calcular el umbral para la relación
5. Seleccione un rectangularRetorno de la inversión en torno a un área ópticamente plana de la célula (s).
6. Medida (acceso directo: m). Nota DESVIACIÓN por media y estándar.
7. Repita dos veces más O se puede dibujar tres cajas a la vez pulsando la tecla 'shift'.
8. Calcular y anotar el umbral para la relación = (1 + SD / media) x 32, con un promedio de los valores de las tres repeticiones / sitios.
   1. c. Celular umbral límite
9. Imagen> Pilas> Z proyecto ... Elige el tipo de proyección: "intensidad media"
10. Imagen> Ajustes> Umbral.
11. Seleccione en blanco y negro.
12. Define 'bajo' (deslizador superior) límite y anotar el valor correspondiente (a la derecha de la barra). Sólo los eventos que ocurren en las regiones negro será contado.
13. Haga clic en 'reset'.
14. Analizar las pilas (acceso directo: 2)
15. Seleccionar sólo una serie en esta etapa, es decir, el archivo 'primero' y 'el último archivo "debe ser el mismo.
16. Introduzca los valores de "umbral de restar", "umbral de proporción" y "umbral borde de la celda. Deje las otras opciones en sus valores predeterminados.
17. El algoritmo se produce una ventana de doble panel en el que se muestra la serie de tratados sobre la izquierda y el original a la derecha. Lea cuidadosamente a través de este para evaluar el número de falsos positivos y las ocasiones en que los acontecimientos, visible a simple vista, no se han detectado. Para conseguir una detección más precisa de los transitorios de Ca ^{2 +,} puede ser necesario ajustar ligeramente algunos de los "parámetros de partículas". Si bien el proceso puede parecer un poco "al azar" en el primer intento, rápidamente consigue una sensación en cuanto a cuáles son los parámetros clave.
18. Para cada serie, el algoritmo genera un archivo de Excel que detalla las características de los eventos detectados (tales como la amplitud, extensión y posición). 'Falsos positivos' - identificado mediante la revisión de los archivos de imagen que el algoritmo de salidas (por ejemplo, paso 8.17) - se puede quitar, a mano, a partir de este archivo de Excel.

Discussion

Elección de los fluorescentes Ca ^{2 +} indicador

Oregon Green 488 BAPTA-1 AM fue elegido como el Ca ^{2 +} indicador debido a que (i) es brillante en comparación con otros indicadores (por ejemplo, Fluo-4 y el verde de calcio) ^1, (ii) es sensible a los cambios fisiológicos en la ^{concentración} de Ca2 ⁺ con una K _d de ^una magnitud similar a la intracelular de Ca ^{2 +} la concentración de [Ca ^{2 +]} i (por ejemplo, de los conductos deferentes ^2), (iii) las cargas de muchas células de músculo liso, permitiendo a las células musculares lisas de acoplamiento a ser monitoreados. Sin embargo, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM es una organización no ratioable Ca ^{2 +} indicador, y como tal no puede ser fácilmente utilizada para determinar la absoluta [Ca ^{2 +]} _i. Además, también pueden proteger a Ca ^{2 +} si está presente en altas concentraciones y se satura con los cambios de gran amplitud en la ^{[Ca2 +]} _i.

La inhibición de la contractilidad espontánea

La contractilidad espontánea de los órganos del músculo liso se puede reducir farmacológicamente, por ejemplo, bloquear el movimiento de Ca ^{2 +} a través de tipo L de Ca ^{2 +} canales (por ejemplo: la nifedipina ^3; diltiazem ^4). Tenga en cuenta que estas drogas en gran medida reducir la amplitud de su conjunto de células Ca ^{2 +} flashes / transitorios.

La contracción de los vasos deferentes resultado de una combinación de la neurotransmisión principalmente purinérgicos y noradrenérgicos. Focal de Ca ^{2 +} transitorios en este tejido, sin embargo, insensible a bloqueo de los receptores noradrenérgicos (por ejemplo, α ₁ adrenérgicos, por prazosina ⁵⁾ lo que el movimiento puede reducirse sin afectar focal Ca ^{2 +} transitorios.

Por otra parte, la contracción se puede prevenir "aguas abajo" a través de la inhibición de la quinasa por ejemplo, la cadena ligera de la miosina por wortmanina ^6.

Conclusiones

Monitoreo Ca ^{2 +} de fluorescencia en submicron resolución es una poderosa técnica para estudiar los efectos post-unión de la liberación de neurotransmisores ^5,7 y la liberación de Ca ^{2 +} de los almacenes internos (por ejemplo, 'chispas' ^8). El análisis de los transitorios de Ca ^{2 +} utilizando la metodología descrita aquí es rentable en comparación con los paquetes disponibles en el mercado de análisis de imagen y permite a la medida a través de un análisis personalizado por escrito plugins de Java para ImageJ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 solution	Invitrogen	P3000MP	20% solution in DMSO
Leica SP2 upright confocal microscope	Leica Microsystems
Air table (‘vibration isolated workstation’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning