Summary
Yüksek çözünürlüklü Ca Detayları yöntemleri
Abstract
Ca 2 + görüntüleme düz kas membran potansiyeli değişiklikleri, iç mağazalardan Ca 2 + gibi serbest bırakılması gibi neden olmayabilir hücresel mekanizmaları içine fikir verir ve birden fazla hücreyi aynı anda izlenebilir, örneğin, değerlendirmek için izin , kaplin sinsityal doku. Hücre içi Ca 2 + transientler düz kas yaygındır, ama doğru bir şekilde ölçmek için zor bir organ bakış genellikle geniş bir alan üzerinde, kendi stokastik oluşumu kaynaklanan sorunlar nedeniyle bu sözleşme eğilimli. Bu sorunu aşmak için, biz, otomatik bir biçimde, bu tür olayların sıklığı, yeri ve genlik kazanmak ve daha sonra analiz etmek için bir dizi görüntüleme protokolleri ve analiz rutinleri geliştirdik. Bu yaklaşım, başka bağlamlarda uygulanabilir olsa da, kendi yerel purinerjik Ca 2 algılama içerir Mikronaltı çözünürlüğe sahip verici sürümü bulmak için transientler .
ATP detrüsör ve vaz deferens düz kas P2X1 reseptörlerine bağlanır otonom sinirler, bir cotransmitter olarak yayınlandı. Ca 2 + purinerjik neuroeffector Ca 2 + transientler (NCTS), düz kas girer. Odak Ca 2 + transientler şekilde elektrofizyoloji üzerinden pek çok avantajı olan bir nörotransmitter serbest optik izleme izin verir. Büyük ölçüde geliştirilmiş uzaysal çözünürlük dışında, optik kayıt anda birçok ayırt sitelerinden verici sürümü kayıt sağlayan ek bir avantaja sahiptir. Ayrıca, optik odak düzlemine korumak ya da hücre içi bir keskin mikroelektrot yeniden daha uzun kayıt serisi sırasında doğru daha kolay.
Özetle, bir görüntüleme Ca 2 + floresan yöntemi ana hatlarıyla hangi detaylar doku hazırlanması, veri toplama ve analizi. Biz böyle bir Ca 2 + transientler analiz için çeşitli scriptler kullanımı anahat.
Protocol
Bölüm 1: Hazırlık Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00)
- Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 AM toz (50 mg) gibi küçük bir miktar 500 ul flakonlarda geliyor. Toz F-127 çözümü, 30 saniye hafifçe sallayarak 40 ul Pluronic ekleyin, daha sonra 460 ul PSS ve 30 saniye hafifçe çalkalanır Nihai çözüm, 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00, 4 x 125 ul alikotları sağlar. -20 C'de saklamak için ışık ve maruz kalmaktan kaçınınız.
Bölüm 2: Ca 2 + yükleme
- Dondurucuda (-20 C) Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00) çıkarın ve oda sıcaklığında çözünme sağlar.
- 1 ml bir tüp ve su banyosu yer PSS alın. % 95 O% 2 / 5 saniyede yaklaşık 1 görünen kabarcık bir oranda CO 2 ile Kabarcık. Bubbler kapamak veya Parafilm ile örneğin tüp içine güvenli olması gerekir.
- Hayvan doku inceleyin ve Sylgard çizgili bir Petri kabındaki, bağ dokusu dikkatli bir şekilde kaldırın. Düz kas organ türü ne olursa olsun, PSS her 10 dakikada yerini olmalı ve doku (PSS üç kez yerine örneğin) ve aşağıdaki diseksiyonu yıkanmalıdır. Vas deferens: doku bir levha üretmek uzunluğu yönlü kesme organ düşünün. Mesane için: kubbenin üst (ön) (arka) mesane boynu boyuna açık. 8 uzun mm ve 1 - baskın kas demetlerinin yönünü kesme detrüsör dorsal yüzeyi boyunca 2 mm genişliğinde, dört şeritler, 6 hazırlayın.
- Place 'önceden ısıtılmış ve kabarmış' PSS doku disseke.
- 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 tüp PM 125 ul ekleyin ve biraz sallamak vermek, elle karıştırmak için.
- Folyo kaplı köpürme ve izin, devam edin. Yeterli doku Ca 2 + göstergesi doku ve düz kas tabakasının kalınlığı boyutu ile değişir almak için zaman alır. Örneğin: 120 dakika (sıçan detrüsör, fare vas deferens) 70 dakika (detrüsör fare, sıçan anococcygeus).
Bölüm 3: mikroskopi için 'Ca 2 + yüklü' doku hazırlanması
Dikkatli doku bağlantılarını doku spontan hareket (nispeten sağlam doku düz kas hücrelerinin görüntüleme bir özelliği) en aza indirmek ve görüntüleme için uygun bir sitenin konumu (düz bir doku parçası gibi olabilir kolaylaştırmak amacıyla gerekli iki boyut yerine üç) inceledi.
- En az 5 dakika süreyle doku kabarmış PSS durulayın.
- Uzanan düz bir levha şeklinde doku (biraz), çizgili Sylgard hazırlık çanak monte edin. Amacı çizebilir uzun 'pimleri' kullanmaktan kaçının; 'pimleri' olarak 25-50 mikron çaplı gümüş tel yerine kısa uzunluklarda ve bir açıyla yerleştirin.
- (Bu superfusion başlar PSS kaplı geniş bir alana yol) PSS Sylgard astarlı çanak alanından kaçmak değildir ki emin olmak için dikkatli olmak, mikroskop sahne hazırlık tabağına yerleştirin.
- PSS ile hazırlık superfuse amacıyla pompa açın. Saatte 100 ml 'lik bir oranı genellikle istihdam edilmektedir.
- Isıtıcı ünitesi açın.
- Hazırlık çanak (tabanı üzerinde mıknatıs metal şerit her iliştirilmesi) giriş ve çıkış tüpleri ve sıcaklık probu yerleştirin. Çıkış tüpünün ucu yüksekliği, derinliği PSS belirleyecektir. Çıkış aslında (bazen başlangıçta olduğu gibi) PSS kaldırıyor sağlamak için dikkatli olun.
- Istenilen sıcaklığa, örneğin 33-35 C ulaşmak için ısıtıcı ünitesi sıcaklığı ayarlayın
- En az 10 dakika süreyle doku gelmesini sağlayınız.
Bölüm 4: site Seçim görüntü
Uyarma aydınlatma maruz kalma göstergesi photobleach, böylece bir seferde birkaç saniye daha fazla kullanmaktan kaçının.
- Düşük güç bir hedef (10x ya da 20x) düz kas görüntülemek ve izlemek için uygun bir bölge belirlemek için, mavi bir ışık ile Epifloresans, heyecan verici kullanın. Hareketi (en az olmalı) ve düz kas hücrelerinin sayısı alanında dayalı bir site almak için deneyin. Parlak 'yapılar', görüntü algılama algoritması 'yanlış pozitif', yüksek bir sayı neden olabilir, bu nedenle çok sayıda (örneğin) serpiştirilmiş epitel hücreleri ve fibroblastlar siteleri kaçının.
- Yüksek bir güç objektif (40x) geçin.
- Düz kas hücre (ler) yatay yalanlar o kadar (yani hızlı tarama eksenine paralel) veya optik eksen sahne döndürün.
Bölüm 5: mikroskopisi
Ayrıntıları konfokal mikroskop 'kurmak' nasıl her mikroskop türü için özeldir, amaen önemli hususlar şunlardır: hızı (en Ca 2 + transientler için gerekli minimum 5 Hz); alan çözünürlüğü ve boyutu (her ikisi de ticareti-hız). Bazı aşağıdaki protokol Leica SP2 dik konfokal mikroskop özel. Tipik bir protokol: 5 Hz (256 x 256 piksel, yaklaşık 100 x 100 mm.) Elde edilen 100 çerçeve serisi, 13.5 Hz (256 x 64 piksel, yaklaşık 100 x 25 mm). Tarama kafası iki yönlü hareket (toplama hızı en üst düzeye çıkarmak için) ve 1000 Hz'de satır başına elde etmek için ayarlayın.
- Bir 'havadar diske' iğne deliği kapatın.
- Bu değeri, parlaklık ve photobleaching arasında bir trade-off; AOTF 25 ve% 35 arasında Lazer (488 nm) güç ayarlayın. (Ikincisi uzun kayıtları sırasında belirli bir sorun.)
- 'Tedavi' başına altı siteleri - site başına altı serisi, ve dört edinin. Önemli photobleaching deneyci bu sapmasına neden olsa da, aynı altı siteleri ön-ilaç (örneğin, 'kontrol') ve post-ilaç izlemek amacı yaygındır.
- 'Zamanı denetimleri yapılmaktadır Ca 2 + görüntüleme gereklidir.
Bölüm 6: analiz için hazırlanması
- Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html: Resim J indirin ve kurun. Platforma özgü versiyonunu indirin ve sonra, http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar son imageJ.jar dosya indirirken, eski dosya yerine en son sürümüne güncelleme. Apple Mac kullanıcıları: yavaş çalışıyorsa, Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/) java sanal makinesi (JVM) en son sürümünü kullandığınızdan emin olun.
- Excel_writer.jar indirin: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html ve Eklentiler [dizin]> kavanoza dizin içine yüklemek.
- JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class: Aşağıdaki dosyaları Eklentiler dizine kopyalayın. Eklentiler kullanarak bu scriptleri her yükleyin [Menü]> Makrolar> Yükle ... ImageJ fonksiyonu.
- Biz yazılım görüntülenebilir içinde tek bir 'film' gibi her serisi üretir Leica SP2 konfokal mikroskop, yazılım (Leica LCS) kullanabilirsiniz, ancak tek tek kare olarak kaydeder. Diziye çerçeveleri yeniden kurmak için: (i) 'kare' tek bir klasörü (örneğin, 'DataFolder> TIFF') olarak yeniden inşa için emin olun. (Ii) Eklentileri [Menü]> Makrolar> Leica_SP2_Stacker seçin. Kök dizini seçin (örneğin, 'DataFolder'). Açılan listesinde (örneğin, 'TIFF /') istediğiniz klasörü seçiniz. Bir çıkış dizini seçin veya yeni bir (örneğin, 'DataFolder> Yığınları') oluşturur. Komut dosyası daha sonra tek tek kareleri serisi yeniden.
Bölüm 7: hareket için düzeltme
Iyi çivileme ile görüntülü sitenin hareketini en aza indirilmeli ve eşit gergin doku olabilir rağmen, bazı düz kas organları yalnız bağlantılarını dikkatli kaldırıldı olamaz spontan kasılmaları sergilerler. Burada bir dizi içinde kare hizalar ya da eşleşen bir serbestçe kullanılabilir algoritma kullanımı açıklanmaktadır.
- 'StackReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ve 'TurboReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
- Eklentiler Eklentiler dizine her yükleyin> Makrolar> Kur ...
- (Dosya> Aç ...) işlenmek üzere bir yığın yükleyin ve daha sonra ilgi alanına açıkça gösteren bir çerçeve taşımak. Diğer çerçeveler bu referans çerçevesi aynı hizada olacak.
- Eklentiler> Yığınları> StackReg. Her biri farklı 'Dönüşümler' (yani Çeviri, Katı Cisim, Ölçekli Rotasyon, Afin) en etkili olduğunu belirlemek deneyin. (Daha fazla detay: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Bölüm 8: Parçacık algılama algoritması
Her bir 'site' görüntülü faktörler Ca 2 + transientler algılama etkileyen değişecektir. Her sitenin belirli özellikleri ('parçacık parametreleri' - detaylı aşağıda) ölçerek, algılama sürecini kolaylaştırdı. Ve 'hücre kenar eşiği' Böylece her site için bir hesaplar için eşik çıkarılır ',' oranı için eşik '.
- Eklentileri [Menü]> Makrolar> Kur ... ve 'JNCT0.08Release.ijm' seçeneğini seçin.
- Eklentileri [Menü]> Makrolar> yük yığını (kısayol: l). Bir dizi seçin ve parçacık parametreleri hesaplamak:
- a. Için eşik çıkarılır (= arka plan)
- 'Arka plan' olarak inandığımız üzerinde dikdörtgen bir ROI seçin.
- Ölçü (kısayol: m). Aşağı Not ORTALAMA.
- b. Oranının hesaplanması eşik
- Bir dikdörtgen seçinHücre (ler) optik düz bir alanı çevresinde ROI.
- Ölçü (kısayol: m). Aşağı ortalama ve standart sapma unutmayın.
- Bir iki kez daha tekrarlayın VEYA 'kayması' tuşuna basarak bir kerede üç kutu çizebilirsiniz.
- Hesaplayın ve eşik oranı için bir yere not = ortalama üç değerleri (1 + SD / ortalama) x 32 / siteler çoğaltır.
- c. Hücre kenar eşiği
- Image> Yığınları> Z proje ... Projeksiyon tipi seçin: 'Ortalama yoğunluğu'
- Image>> Eşik ayarlayın.
- Siyah ve beyaz seçin.
- 'Altında' tanımlayın (üst kaydırıcıyı) limit ve karşılık gelen değeri (kaydırıcıyı sağa) bir yere not edin. Sadece siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılabilir.
- 'Reset' düğmesini tıklayın.
- Yığınları (2 kısayol) analiz
- Bu aşamada sadece bir seri seçin, yani 'ilk dosya' ve 'son dosya ile aynı olmalıdır.
- 'Çıkarılır için eşik' ve 'hücre kenar eşiği', 'oranı için eşik değerleri girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerine bırakın.
- Algoritma işlenmiş serisi sol tarafta görülen ve sağda orijinal olduğu bir çift bölmeli pencere üretecektir. Yanlış pozitif ve gözle görünür olaylar, tespit edilmemiş olduğu durumlarda sayısını dikkatli bir şekilde değerlendirmek için bu geçmesi. Ca 2 daha doğru bir algılama almak için + transientler biraz 'parçacık parametreleri' bazı ayarlamak için gerekli olabilir. Sürecin bir 'küçük isabet ve kaçırmak' gibi ilk girişimi olsa da, hangi parametreleri temel olarak bir hızla hissediyorum alır.
- Algoritması her bir serisi için, bir Excel dosyasını üretir, tespit edilen olayın ayrıntıları özellikleri (genlik, alan ve pozisyon gibi). 'Yanlış' - Bu Excel dosyası, el kaldırılır olabilir algoritma çıkışları (örneğin adım 8.17) bu görüntü dosyalarını inceleyerek tespit.
Discussion
Seçimi floresan Ca 2 + göstergesi
Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 (i) diğer göstergeleri (örneğin Fluo-4 ve Kalsiyum Yeşil) 1 ile karşılaştırıldığında, parlak, çünkü AM Ca 2 + göstergesi seçildi, (ii) Ca 2 fizyolojik değişimlere duyarlıdır + konsantrasyonu (iii) yükleri çok sayıda düz kas hücreleri, düz kas hücre izlenebilir Kaplin sağlayan, hücre içi Ca 2 + konsantrasyonu [Ca 2 +] i (örneğin, vaz deferens 2) benzer büyüklükte 1 K d Ancak, Oregon Yeşil 488 BAPTA 1:00 olmayan bir ratioable Ca 2 + göstergesi, gibi kolayca mutlak belirlemek için kullanılan olamaz [Ca 2 +]. Ayrıca, Ca 2 + mevcut ise yüksek konsantrasyonlarda tampon ve [Ca 2 +] yüksek genlik değişiklikleri ile doymuş olur.
Spontan kontraktilite inhibisyonu
Ca 2 + kanalları + L-tipi Ca 2 üzerinden (nifedipin 3 diltiazem 4 örneğin) hareketini engelleyerek düz kas organların kendiliğinden kontraktilite gibi, farmakolojik azaltılmış olabilir. Not bu ilaçların tam hücreli Ca 2 + yanıp söner / transientler genlik büyük ölçüde azaltacaktır .
Vaz daralma öncelikle purinerjik ve noradrenerjik sinir iletiminin bir arada deferens. Ancak, bu doku Odak Ca 2 + transientler noradrenerjik reseptör blokajı (örn. α 1 adrenoseptör, prazosin 5) hareketinin odak Ca 2 + transientler etkilemeden azalabilir duyarsız.
Alternatif olarak, daralma wortmannin 6 miyozin hafif zincir kinaz örneğin inhibisyonu yoluyla 'downstream' önlenmiş olabilir.
Sonuçlar
Mikronaltı çözünürlük Ca 2 + floresan İzleme nörotransmitter sürüm 5,7 post-junctional etkilerini incelemek ve Ca 2 + iç depolar (örneğin, 'kıvılcım' 8) serbest bırakılması için güçlü bir tekniktir. Ca 2 + metodoloji kullanarak transientler burada özetlenen analizi piyasada bulunan görüntü analiz paketler ile karşılaştırıldığında maliyet-etkin ve ImageJ için özel yazılmış Java eklentileri yoluyla ısmarlama analiz sağlar.
Disclosures
Kullanılan hayvanların sayısı ve onların acıları en aza indirmek için çalışmalar yapıldı; tüm deneyler, Birleşik Krallık Animals (Scientific Procedures) Act 1986 ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/09/EEC uyarınca yapılmıştır.
Acknowledgments
Wellcome Trust sağlanan mali destek (VIP JSY ve KLB için 074.128 Araştırma Bursu Ödülü). Tıbbi Araştırma Konseyi Bursu RJA için
Leica_SP2_Stacker, TIFF 'yeniden yapılanma' için bir dizi içine almak için kullanılan bir algoritma, Leica_tiff_sequence onun izni ile Tony Collins tarafından geliştirilen ve kullanılan ImageJ Leica SP2, TIFF, okumak için bir eklenti dayanmaktadır.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg ve TurboReg, doku hareketi düzeltmek için kullanılan algoritmalar, Pe venaz ve arkadaşları (1998) 9 dayanmaktadır.
Excel_writer.jar Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html) tarafından yazılmıştır.
JNCT0.08JoVE.ijm, parçacık algılama algoritması, KL Beyin tarafından yazılmış ve daha önce 5 detaylı bir algoritma dayanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport Corp. | M-VW-3046-OPT-012140 | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
- Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).
- Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse. Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).
- Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. J Physiol. 150, 273-286 (2001).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
- Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens. J. Physiol. 541, 849-862 (2002).
- Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).
- Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder. J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).
- Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, 633-637 (1995).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).
