Summary
Объективы развития предполагает взаимодействие с другими тканями. Несколько мутантов глаз данио рерио характеризуются аномально малый размер объектива. Здесь мы показываем, эксперимент объектив трансплантации определить, является ли этот фенотип из-за внутренних причин или дефектные взаимодействия с тканями, которые окружают линзы.
Abstract
Линзы играет важную роль в развитии глазного бокала [1,2]. Использование данио, как модель организма, вопросы, касающиеся развития линзы могут быть решены. Данио полезно для генетических исследований из-за нескольких выгодных характеристик, в том числе небольшие размеры, высокую плодовитость, короткий жизненный цикл, и простота ухода. Объективы развитие происходит быстрее в данио. К 72 HPF, данио рерио линза функционально зрелые [3]. Обильные генетические и молекулярные ресурсы для поддержки исследований в данио. Кроме того, сходство данио глаз, чтобы у других позвоночных, обеспечивает основу для ее использования в качестве отличной моделью животным человеческие пороки [4-7]. Несколько мутантов данио выставку объектив аномалий, включая высокий уровень гибели клеток, которые в некоторых случаях приводит к полной дегенерации тканей линзы [8].
Для определения того, объектив отклонения из-за внутренних причин или дефектные взаимодействия с окружающими тканями, трансплантация мутант линзы в дикого типа глаз не выполняется. Использование пожарной полированного металла иглы, мутант или дикого типа линз тщательно расчлененный от донора животное, и переданы в хосте. Чтобы отличить дикого типа и мутантных тканей, трансгенной линии используется в качестве донора. Эта линия выражает мембраной GFP во всех тканях, в том числе линза. Этот метод трансплантации является важным инструментом в изучении мутантов данио линзы.
Protocol
Часть 1: Подготовка эмбрионов
В этом протоколе, мы будем использовать символ JJ ху для обозначения гипотетической мутант объектив рыбок данио.
- Данио рерио штаммов ведутся в стандартных условиях объекта рыбы на 28,5 С на 14h light/10h темно цикла.
- Вечером, место мужчин и женщин штамма данио JJ ху: AB / ТУ; тг (mGFP) в бак с делителя отделить их друг от друга. Потомство этот крест будет выражать GFP трансгенов во всех тканях, и будет использоваться в качестве доноров. Параллельно, используйте ту же процедуру, чтобы создать скрещивания нетрансгенных животных дикого типа. В зависимости от цели этого эксперимента, можно пересечь животных дикого типа в локусе JJ ху в качестве доноров или хостов.
- В течение одного часа после загорится утром, удалить делителей, чтобы рыба для спаривания.
- После 15-30 минут сбора эмбрионов в 100 х 15 мм чашки Петри, очистите их и изменять среду (яйцо воды).
- Держите эмбрионов в инкубаторе 28,5 С до нужного времени.
- Когда все будет готово для трансплантации, удалить вручную хориона с двумя парами резкое щипцы, и инкубировать эмбрионов в 0,2% ЭДТА в бескальциевой ZFR течение 30 минут.
Часть 2: Подготовка рассечение иглы
- Процедура трансплантации требуется два типа игл: заостренные один, который используется для резки тканей, окружающих линзы, снимите хориона, и освободить эмбрионов из агарозы и тупой иглой используются для перемещения доноров объектив и вставить его в хозяина. Здесь мы покажем вам, как сделать эти иглы.
- Во-первых, кончиком пипетки Пастера надо отрезать ножом алмаза. Затем вставьте стеклянный капилляр на кончике пипетки Пастера, так что около половины ее длины внутри нее. Это позволит сделать его проще для иммобилизации вольфрамовой проволоки путем плавления его в стекло в следующем шаге.
- Затем вставьте тонкой вольфрамовой проволоки в открытый конец капилляра. Растопить стекла по проводам с горелкой Бунзена. Использование щипцов, удерживая устойчивые стекло заканчивается металлической проволоки в то время как крутящий другом конце иглы с вашей стороны. Смягчил стекло должно спираль вокруг захвата металла на месте.
- Если вы делаете тупой иглой, то это конец процедуры. Чтобы создать заостренные иглы, удерживая вольфрамовой проволоки над горелкой Бунзена в течение 1-1,5 минут, сжигая металл, очень тонкий кончик создается. Проверьте качество наконечника, microscropy.It это хорошая идея для стерилизации игл и в пламени в течение нескольких секунд непосредственно перед трансплантацией.
Часть 3: Подготовка реагентов
- Кальций без данио рерио Рингера (ZFR) Решения (116 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 5 мМ HEPES, рН 7,2)
- 0,2% ЭДТА в бескальциевой Решения данио рерио Рингера (рН 7,2)
- 1,2% агарозы (низкой температурой плавления) в бескальциевой ZFR
- 0,2% агарозы (низкой температурой плавления) в бескальциевой ZFR
- Эмбрион среды (рН 7,0, за литр содержит: 10 мл Хэнкс Решение № 1, 1 мл Хэнкс Решение № 2, 10 мл Хэнкс Решение № 4, 10 мл Хэнкс Решение № 5, 0,35 г натрия бикарбоната, 300 мкл 2М HCl, пенициллин стрептомицин 500000 U), как и в книге данио рерио (Университет штата Орегон Press, 2000).
- Вольфрамовая проволока, позолоченные, диаметр 0,1 мм, Альфа Aesar
- Капиллярная трубка, диаметром 1,0 мм, инструменты Всемирного Precision
Часть 4: Трансплантация процедуры
- В пластиковой трубки центрифуги, подготовить 1,2% низкой температурой плавления агарозы в бескальциевой ZFR предварительно нагретую до 40 ° С на водяной бане.
- В нужном этапе (30 HPF, например), возьми эмбрионов в пипетки Пастера медленно изгнать их в центрифуге трубку, и медленно изгнать их в центрифуге трубки и инкубировать в течение 5 секунд. Донорами и хостов должно быть инкубировали отдельно.
- С пипетки, возьми эмбрионов в 1,2% агарозном из центрифуги трубки и расположить их в два параллельных ряда на 100 мм полистирола блюдо Петри, держа узлов и отдельных доноров. По их из пипетки медленно и осторожно, большинство эмбрионов будут лежать на боку в агарозы. Вам нужно будет переориентировать те, которые не лежат в этом положении с помощью тупой иглой, так что глаза вверх до агарозном затвердевает.
- Подождите, 1,2% агарозном укрепить, а потом обложи его 0,2% раствор низкой температурой плавления агарозы.
- Использование заостренные иглы, удалите все агарозном вокруг глаз, и очень аккуратно вырезать линзы из хозяина и доноров эмбрионов с помощью небольших штрихов. Убедитесь в том, чтобы сократить как раз достаточно близко к объективу, чтобы не порвать ее, но и чтобы не удалить слишком много ткани от остальной части хоста глаз.
- После освобождения линз будет плавать в среде. Использование тупой иглой, осторожно подтолкнуть доноровобъектив чуть выше места, где хозяин объектив будет нормально, а затем нажмите ее на глаз с тупой иглой. Хост объектив может быть отброшена.
- Оставьте донора и реципиента эмбрионов в 1,2% агарозном в течение 30-60 минут, затем освободить их от агарозы использованием острой иглой, и переносить их в 24-луночный планшет с эмбрионом среды. Каждый эмбрион должен занимать отдельное хорошо. Убедитесь в том, чтобы маркировать скважин должным образом, так что ясно, какой хост соответствует какому-доноров.
- Инкубируйте при 28,5 С. доноров полученных линзы можно отличить от принимающей линзы на неоперированных стороны одного и того же животного на основе GFP флуоресценции. Разделы могут быть сделаны для измерения размера объектива и для определения его отличает должным образом.
Рис. 1 Низкий увеличения изображения из заостренные иглы используются для линз трансплантации. Стеклянный капилляр (B) вставляется в пипетку Пастера (), а тонкая вольфрамовая нить (С) вводится в открытый конец капилляра. Стекла по проводам смягчается с горелкой Бунзена. Использование щипцов, удерживая устойчивые стекло заканчивается металлической проволоки в то время как крутящий другой конец пипетки Пастера с вашей стороны. Смягчил стекло должно спираль вокруг металла, сжимая ее на месте.
Рис. 2 кончики два вида иглы, используемые для объектива трансплантации.
Рис. 3 эмбрионов подверглись трансплантации в объектив 30hpf. Показаны доноров эмбрионов (А, В), принимающих на глаз с пересаженной линзы (C, D), а также контроль стороне хоста эмбриона (E, F). Каждый глаз показан в обоих проходящего света и ультрафиолетового освещения, как указано. Фотографии были сделаны в 48 HPF. Q01 [9] трансгенной линии была использована в данном эксперименте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько шагов требуют особого внимания при смене объективов трансплантации.
- Заостренный игл: Лучше подготовить несколько игл перед проведением трансплантации линзы, а кончик иглы должны быть как можно тоньше. Толстая игла порвется больше ткани из-за его более широкий диаметр, вызывая сбой в глаза, чтобы зажить.
- Организация эмбрионов: Прямо перед трансплантацией необходимо позиции эмбрионов, поэтому они лежат на боку. При позиционировании, 1,2% агарозном может затвердеть очень быстро. Чтобы замедлить затвердевание агарозы, чашки Петри может быть разогретой, позволяя ему плавать в 40 ° С водяной бане.
- Перед установкой доноров линзы в глаз хост, постарайтесь удалить как можно больше агарозном вокруг головы хост насколько это возможно. Проще вставить доноров линзы таким образом.
- Сразу после линзы трансплантации эмбрионов должно быть оставлено встроенный в 1,2% агарозном слой покрывается слоем 0,2% агарозы. Добавление эмбриона среде с антибиотиками будет способствовать заживлению ран как доноров, так и принимающих эмбрионов. Подождите 30-60 минут перед выпуском эмбрионов из агарозы, а затем передать их в 24-луночный планшет с эмбрионом среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта процедура следует в значительной степени технику трансплантации, разработанные для пещера рыбы лаборатории Билл Джеффри.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
- Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
- Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
- Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
- Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
- Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).
