Summary
Lens utveckling innebär interaktion med andra vävnader. Flera zebrafisk ögat mutanter karaktäriseras av en onormalt liten lins storlek. Här visar vi ett experiment lins transplantation för att avgöra om denna fenotyp beror på inneboende orsaker eller defekt interaktion med vävnad som omger linsen.
Abstract
Linsen spelar en viktig roll i utvecklingen av optiska bägaren [1,2]. Använda zebrafisk som modell organism, kan frågor kring objektiv utveckling tas upp. Den zebrafisk är användbar för genetiska studier på grund av flera fördelaktiga egenskaper, inklusive små, hög fruktsamhet, kort livslängd och enkel vård. Lens utvecklingen sker snabbt i zebrafisk. Genom 72 HPF är zebrafisk objektivet funktionellt mogna [3]. Rik genetiska och molekylära resurser finns tillgängliga för att stödja forskning inom zebrafisk. Dessutom ger de likartade zebrafisk ögat som för andra ryggradsdjur grunden för dess användning som ett utmärkt djurmodell av mänskliga fel [4-7]. Flera zebrafisk mutanter uppvisar lins avvikelser, bland annat höga halter av celldöd, som i vissa fall leder till en total degeneration av objektiv vävnader [8].
För att avgöra om linsen avvikelser beror på inneboende orsaker eller att defekt interaktion med omgivande vävnader, är transplantation av en mutant objektiv till ett wild-type öga utförs. Använda brand-polerad metall nålar, muterade eller vildtyp linserna är noggrant dissekeras från donatordjuret, och överföras till värden. För att skilja vildtyp och mutant vävnader, är en transgen linje används som givare. Denna linje uttrycker membranbundna GFP i alla vävnader, inklusive linsen. Denna transplantation teknik är ett viktigt verktyg i studier av zebrafisk lins mutanter.
Protocol
Del 1: Förbereda embryon
I detta protokoll kommer vi att använda JJ xy symbolen för att beteckna en hypotetisk mutant zebrafisk lins.
- Zebrafisk stammar upprätthålls under standardförhållanden fisk anläggning vid 28,5 C på en 14h light/10h mörker-cykel.
- På kvällen, placera män och kvinnor i zebrafisk stam JJ xy: AB / TU, TG (mGFP) i en tank med en avdelare för att skilja dem från varandra. Avkomman av detta kors kommer att uttrycka GFP transgenen i alla vävnader, och kommer att användas som givare. Parallellt använda samma procedur för att ställa in kors mellan icke-transgena vildtyp djur. Beroende på syftet med detta experiment kan man korsa djur wild-type på JJ xy-locus som givare eller värdar.
- Inom en timme efter att ljuset tänds på morgonen, ta bort avdelare så att fisken att para sig.
- Efter 15-30 minuter samla embryon i 100 x 15 mm petriskålar, rengöra dem och ändra medium (ägget vatten).
- Håll embryona i en 28,5 C inkubator tills önskad tid.
- När de är färdiga för transplantation, ta bort chorion manuellt med två par vassa pincett, och inkubera embryona i 0,2% EDTA i kalcium-fri ZFR i 30 minuter.
Del 2: Förberedelse av dissektion nålar
- Transplantation Förfarandet kräver två typer av nålar: en vässad en, som används för att skära vävnad som omger linsen, ta bort chorion, och embryon befrielse från agaros, och en trubbig nål används för att flytta givaren objektivet och sätt in den värd. Här kommer vi att visa dig hur man gör dessa nålar.
- Först måste spetsen på en pasteurpipett skäras bort med en diamant kniv. Sätt sedan ett glas kapillär i pasteurpipett spets så att ungefär hälften av dess längd är inuti den. Det gör det lättare att immobilisera volfram tråd genom att smälta det i glaset i nästa steg.
- Sätt sedan en tunn volfram ledningen i den öppna änden av kapillär. Smält glas över kabeln med en bunsenbrännare. Använd pincett, håll stadigt glaset änden med metalltråd och samtidigt vrida den andra änden av nålen med handen. Det mjuka glaset bör spiral runt metallen gripande den på plats.
- Om du gör en trubbig spets nål, då detta är slutet av förfarandet. För att skapa en vass nål, håll volfram tråd över en Bunsenbrännare för 1-1,5 minuter, bränna bort metallen så en mycket fin spets skapas. Kontrollera kvaliteten på spetsen av microscropy.It är en bra idé att sterilisera både nålar i lågan under några sekunder omedelbart före transplantation.
Del 3: Beredning av reagens
- Kalcium-fri Zebrafish Ringers (ZFR) lösningar (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 5 mm HEPES, pH 7,2)
- 0,2% EDTA i kalcium-fri Zebrafish Ringerlösningar (pH 7,2)
- 1,2% agaros (låg smältpunkt) i kalcium-fri ZFR
- 0,2% agaros (låg smältpunkt) i kalcium-fri ZFR
- Embryo medium (pH 7,0, per liter innehåller: 10 ml Hanks Lösning # 1, 1 ml Hanks Lösning # 2, 10 ml Hanks Solution # 4, 10 ml Hanks Solution # 5, 0,35 g natriumbikarbonat, 300 ul 2M HCl, penicillin-streptomycin 500.000 U) som i Zebrafish bok (University of Oregon Press, 2000).
- Tungsten tråd, guldpläterad, 0,1 mm diameter, Alfa Aesar
- Kapillärrör, 1,0 mm diameter, Världen precisionsinstrument
Del 4: Transplantation förfarande
- I en plast-centrifugrör, förbereda 1,2% låg smältpunkt agaros i kalciumfri ZFR förvärmas till 40 C i ett vattenbad.
- På önskad stadiet (30 HPF, till exempel), tar upp embryona i en pasteurpipett, sakta utvisa dem i centrifugrör och långsamt utvisa dem i centrifugrör och inkubera i cirka 5 sekunder. Givarna och värdar ska inkuberas separat.
- Med en pipett upp embryon i 1,2% agaros från centrifugröret och ordna dem i två parallella rader i en 100mm polystyren petriskål, hålla värdar och givare separat. Genom att pipettera ut dem långsamt och försiktigt, kommer de flesta embryon ligga på sina sidor i agaros. Du måste omorientera de som inte ligger i denna position med hjälp av trubbiga nålen så att ögat är vänd uppåt innan agarosen stelnar.
- Vänta på 1,2% agaros att stelna, och sedan överdraga det med 0,2% låg smältpunkt agaroslösningen.
- Med hjälp av vässade nålar, ta bort alla agarosen runt ögonen, och mycket noggrant skära ut objektivet från värden och embryon givare med hjälp av små stroke. Se till att klippa precis tillräckligt nära för att linsen för att inte riva det, men också så att du inte tar bort för mycket vävnad från resten av värden ögat.
- När fri, kommer linser flyta i mediet. Med hjälp av trubbiga nålen, försiktigt in givarenlins för att strax ovanför den plats där värden lins skulle vara normalt, och tryck sedan ner det i ögat med den trubbiga nålen. Värden Objektivet kan kasseras.
- Lämna givare och värd embryon i 1,2% agaros i 30-60 minuter, sedan släppa dem från agarosen med vass nål, och överföra dem till en 24-brunnar embryo medium. Varje embryo skall ha en egen väl. Se till att märka brunnar ordentligt så att det klart framgår vilken värd motsvarar som donator.
- Inkubera vid 28,5 C. Givaren som härrör lins kan skiljas från värden linsen på oanvänd sidan av samma djur baserad på GFP fluorescens. Sektioner kan också göras för att mäta lins storlek och att avgöra om det skiljer ordentligt.
Fig.. 1 låg förstoring bilden av en vass nål som använts för objektiv transplantation. Ett glas kapillär (B) sätts in i pasteurpipett (A) och en tunn volfram tråd (C) sätts in i öppna änden av kapillär. Glaset över kabeln mjukas upp med en bunsenbrännare. Använd pincett, håll stadigt glaset änden med metalltråd och samtidigt vrida den andra änden av pasteurpipett med handen. Det mjuka glaset bör spiral runt metall, gripande på plats.
Fig.. 2 Spetsarna på två typer av nålar som används för objektiv transplantation.
Fig.. 3 Embryon genomgick lins transplantation vid 30hpf. Som visas är en donator embryo (A, B), en värd öga på med transplanterade lins (C, D), och kontroll sida värd embryot (E, F). Varje öga visas i både ljus och UV-belysning som anges. Fotografier togs på 48 HPF. Den Q01 [9] transgena linje användes i detta experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera steg kräver särskild uppmärksamhet under lins transplantationer.
- Vässade nålar: Det är bättre att förbereda flera nålar innan de utför lins transplantation, och spetsen på nålar bör vara så tunn som möjligt. En tjockare nål kommer slita mer vävnad på grund av sin större diameter, vilket orsakar ett fel i ögat att läka.
- Arrangera embryona: Precis innan transplantation Du måste placera embryon så att de ligger på deras sidor. När positionering, 1,2% agaros kan hårdna mycket snabbt. Att bromsa härdning av agaros kan petriskål förvärmas genom att låta det flyta i en 40 ° C vattenbad.
- Innan du sätter givaren objektivet i den mottagande ögat, försök ta bort så mycket agarosen runt värd huvudet som möjligt. Det är lättare att sätta givaren objektivet på det sättet.
- Strax efter lins transplantation av embryon bör lämnas inbäddade i 1,2% agaros lager som täcks av ett 0,2% agaros lager. Lägga embryo medium med antibiotika kommer att främja sårläkning hos både givare och embryon värd. Vänta 30-60 minuter innan du släpper embryon från agaros, och sedan överföra dem till en 24-brunnar embryo medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta förfarande följer i stor utsträckning transplantation tekniken utvecklats för grottan fisk labbet av Bill Jeffrey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
- Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
- Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
- Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
- Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
- Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).
