Summary
פרימטים שאינם בני אדם היא מין translational חשוב להבנת עיבוד תקין של המוח. הארגון האנטומי של המוח הפרימטים יכול לספק תובנות חשובות בתנאים נורמליים ופתולוגיים אצל בני אדם.
Abstract
השימוש הלא אנושי פרימטים מספק מודל translational מצוינת להבנת תהליכים התפתחותיים הזדקנות בבני אדם
Protocol
חלק 1: טרום עיבוד של רקמות
- רקמות צריך להיות perfused היטב עם paraformaldehyde, glutaraldehyde, או פורמלין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות זלוף transcardial הסטנדרטית המשמשת בדרך כלל כדי לקצור איברים אחרים. במחקר הנוכחי הנושא היה מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ"ג / ק"ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ"ג / ק"ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד לחלוטין exsanguinated.This לאחר מכן על ידי פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר).
חלק 2: חסימת Stereotaxic
- לפני הנחת הראש לתוך מסגרת stereotaxic את הקואורדינטות של אפס המטוס Horsley-Clarke/interaural צריך לקחת. זוהי נקודת האמצע התיאורטי בין האוזניים. כדי למדוד את המטוס הזה, הברים האוזן צריך להיות מצויד לא פחות במנגנון, אז במקום להב אזמל בזרוע מניפולטור stereotaxic ולמדוד את נקודת האמצע בין הסורגים האוזן. זה חשוב לקביעת שם כדי לחסום את רקמת המבוססים על צרכי המחקר. ברגע זה הוא סיים הגולגולת צריך להיות מוכן קיבעון לתוך המנגנון stereotaxic.
- כדי למקם את הראש לתוך מסגרת stereotaxic הלסת התחתונה יהיה צורך להסיר עם rongeurs עצם אזמל. בנוסף העור, שרירים, רקמות חיבור יש להסיר כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר רקמת חיבור יוסר הגולגולת, לחשוף את המוח על ידי לפורר את מכסה הגולגולת (החלק טבלאי של העצם העורפית וכן הקודקודית, עצמות מודעה חזיתית). בחלק הניסוי הנוכחי של מכסה הגולגולת יש הכל מוכן הוסר. היזהרו לא להסיר לחלוטין את העצמות הטמפורלית כי תעלות האוזן צריך להיות תמים כדי למקם את הראש לתוך מסגרת stereotaxic. עניין הנותרים הדורה יש להסיר מן המוח החשוף. הגולגולת עכשיו הוא מוכן להציב לתוך מסגרת stereotaxic.
- באותו אופן שבו אפשר היה לבצע ניתוח stereotaxic, להתאים את העין, החיך, וברים האוזן כזה ראש קבוע מאובטח במנגנון stereotaxic. מניחים את מניפולטור stereotaxic את הקואורדינטות קדמית / אחורית (A / P) מראש ולהעביר את מניפולטור להיבט לרוחב של המוח. לאט לאט להוריד את הלהב לתוך המוח, להעלות את הלהב לחלוטין מהמוח, ואז להעביר מדיאלית ולהפחית את הלהב שוב. חזור על שני השלבים עד הלהב הגיע היבט לרוחב של חצי הכדור ההפוך. זה משלים את הבלוק העטרה הראשונה. עבור בלוקים העטרה לאחר מכן להעביר את 1cm מניפולטור של ציר P / וחזור עד המוח כולו נחסם.
חלק 3: הסרת המוח מהגולגולת
- הסר את הראש מן המסגרת stereotaxic והחזק את המוח נחשף כף היד שלך. נסו לאבטח את המוח על ידי הצבת קלות למעוך את המוח בכף ידך מקום אצבע הזרת שלך על פני האונות המצחיות, תנועה זו מקטינה של המוח בגולגולת. על מנת למנוע את התייבשות פני השטח pial של המוח, במקום פיסת גזה לחה PBS ברחבי המוח. החזק את הראש בחוזקה על ידי הגולגולת לכרסם עצמות העורפית ובזמן הנותר יחד עם עמוד השדרה. זה חושף את הבסיס לרוחב היבטים של המוח. לבסוף להסיר כל העצם הפרונטלית הנותרים ואת עצם האף, אשר יאפשר גישה נורות חוש הריח. חשוב להסיר את העצם הקדמית האחרון כי כמו שתסיר את בסיס הגולגולת במוח נע מעט האונות הקדמיות יכולה להתקלקל על קצוות משוננים של העצם fontal. לחתוך ולהסיר הנותרים משנה הדורה. הרם בזהירות את הקדמי של המוח, החלק את אזמל תחת המוח לשחרר את המוח מהגולגולת.
חלק 4: מדידות
- ישנם מספר של מדידות שימושי יכול להתבצע לפני ההקפאה. לדוגמה, A / P ציר של המוח עם קליפר. יתר על צפיפות מסוימת ניתן למדוד על ידי שקילה המוח, מדידת נפח ידי עקירה של מים בתוך גליל סיימה אז חלוקת המשקל על ידי עקירה נפח (טבלה 1).
חלק 5: סיום חוסמים את המוח.
- בדרך כלל כאשר להב סכין המנתחים מוחדר לתוך המוח זה לא מספיק זמן כדי לחדור לחלוטין את מלוא הגבי-הגחוני של המוח. ברגע שהמוח מוסר ומידות ברוטו מתקבלים, לקחת סכין חיתוך רקמות ולסיים חוסמים את המוח דרך בצד הגחוני של המוח (איור 2).
- לפני הקפאת בלוקים, יש צורך cryoprotect הרקמה ב-PBS שנאגרו פתרונות מדורגים סוכרוז (10, 20, ו 30%) שמרו על 4 ˚ C עד כיורים המוח. זה בדרך כלל לוקח הדגירה לילה 10%, 2-3 ימים 20% נוספים 3-5 ימים 30% עבור אבני לשקוע בתחתית המיכל. שינוי יומי של הפתרון דואר סוכרוז 30% מומלץ.
חלק 6: תוצאות נציג
ישנם מספר של מדידות מורפולוגיים ברוטו שניתן לעשות פעם את המוח הוסר הגולגולת. אלה כוללים את אורך / P, משקל, צפיפות מסוימת (טבלה 1). בדרך כלל אנחנו חוסמים את המוח תוך 6-7 בלוקים מדידה 1cm (איור 1). כל תכשיט הוא צילם אז (איור 2) ניתן גזור נוספים בהתאם לצורכי מחקר או מוכן להקפאה בפתרונות סוכרוז מדורגים.
נושא | אורך / P (מ"מ) | משקל (גרם) | מים עקירה (מ"ל) | ספציפיות צפיפות (גרם / מ"ל) |
| O2303-2-1-1 | 64.3 | 28.1 | 24 | 1.171 |
| O5180-1 | 71.3 | 38.7 | 34 | 1.138 |
| O2708-3-1 | 62.8 | 28.7 | 26 | 1.104 |
| O9184-4-2 | 65.3 | 29.5 | 24 | 1.229 |
| N459-1-14-2 | 68.2 | 31.6 | 26 | 1.215 |
| ממוצע | 66.38 | 31.32 | 26.8 | 1.171 |
| STD dev | 3.38 | 4.33 | 4.17 | 0.052 |
טבלה 1. מדידות מורפולוגי הגולמי של האונה הימנית של 5 Vervets ישן חודש
באיור 1. שרטוטים של מטוסים העטרה המשמש חוסמים את המוח. זוהי דוגמה של המוח המבוגר מוחצן vervet. דוגמה של ההליך חוסם. הקווים האנכיים כאן הם במרווחים של 1 ס"מ, בדרך כלל לייצור בלוקים 7 העטרה מן האונה כל.
איור 2. בלוקים של רקמת המוח בחלל stereotaxic. לחסום כל תניב כ -200 סעיפים נלקחה ב 50μm. בעזרת שיטה זו הדגימה מעל 1200 חלקים דרך קליפת יילקחו ו 400-500 נוספים במוח הקטן, כאשר פרוס במישור העטרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סנט קיטס vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) הוא קוף עולם ישן עם דפוסים שיעורים דומים של התפתחות המוח הקורטיקליים קורטיקליים לזו של בני האדם. מין זה שימש מודל מורכב הפרעות התנהגות אנושית כמו התנהגות חרדה, יתר לחץ דם 8, 9 hemispherectomy, מחלת פרקינסון 10, מחלת Alzhemier 11, אלכוהול 12. לאחרונה, מין זה נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעות של חשיפה neuroanatomical נטורליסטי אתנול טרום לידתי. Vervets בהריון הורשו לשתות את המקבילה של 3-5 מנות סטנדרטיות ארבע פעמים בשבוע במהלך השליש השלישי אנו מדווחים כי ישנה ירידה של 35% של נוירונים בקליפת המוח הקדמית 13. המוח במחקר זה נחסמו stereotaxically כזה רק 3 מתוך 7 בלוקים צריך להיות מחולק כדי להשלים את הערכה stereological של קליפת המוח הקדמית. טכניקה זו בפרט אינה מוגבלת המוח הלא אנושי הפרימטים, אך ניתן להרחיב את המוח מכרסם גם כן. לדוגמה, אם הקליפה החושית של חולדה הוא האזור של עניין, לחתוך stereotaxic הקדמי ואת האחורי לאזור זה יכול להתבצע באמצעות מסגרת stereotaxic מכרסמים. זה מספק באזור קטן סעיף ומטוס העטרה תקן בין בעלי חיים. חשוב לציין כי את הלהב חייב להיות חזר בו באופן מלא מהמוח לפני כל תנועה medial-lateral הוא עשה עם המניפולטור stereotaxic אחרת הלהב יהיה בלתי בהכרח הנזק המוחי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות Ikiel Ptito לקבלת תמיכה טכנית המשיכה שלו. NSERC להעניק MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | ||
| Tissue slicing blade | Thomas Scientific |
References
- Gallagher, M., Rapp, P. R. The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48. , 339-370 (1997).
- Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Nowakowski, R. S., Rakic, P. The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey. J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).
- Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex. Science. 232, 232-235 (1986).
- Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex. J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).
- Zecevic, N., Rakic, P. Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex. J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).
- Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures. Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).
- Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors. Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).
- Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy. Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).
- Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).
- Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet. Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).
- Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys. Neuroreport. 7, 457-462 (1996).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
