Summary
Le primate non-humain est une espèce importante pour notre compréhension de translation du traitement normal du cerveau. L'organisation anatomique du cerveau des primates peuvent fournir des indications importantes sur les conditions normales et pathologiques chez l'homme.
Abstract
L'utilisation de primates non-humains fournit un excellent modèle de translation pour notre compréhension des processus de développement et le vieillissement chez les humains
Protocol
Partie 1: Pré-traitement des tissus
- Les tissus doivent être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d'autres organes. Dans l'étude actuelle, l'objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu'à ce que complètement exsanguinated.This est suivie par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre).
Partie 2: le blocage stéréotaxique
- Avant de placer la tête dans le cadre stéréotaxique les coordonnées de l'avion à zéro Horsley-Clarke/interaural doit être pris. C'est le point central théorique entre les oreilles. Pour mesurer ce plan, les barres d'oreilles doivent être également monté dans l'appareil, puis placez une lame de scalpel dans le bras manipulateur stéréotaxique et de mesurer le point médian entre les barres d'oreilles. Ceci est important pour déterminer où pour bloquer le tissu en fonction des besoins de recherche. Une fois ceci terminé le crâne doit être préparé pour la fixation dans l'appareil de stéréotaxie.
- Afin de placer la tête dans le cadre stéréotaxique la mâchoire inférieure devra être enlevé avec Os Rongeurs et d'un scalpel. En outre, la peau, les muscles et le tissu conjonctif doivent être enlevés afin d'exposer le crâne. Une fois le tissu conjonctif est retiré de la boîte crânienne, d'exposer le cerveau en éliminant progressivement la voûte crânienne (la partie de tableau de l'os occipital ainsi que les pariétaux, les os frontaux ad). Dans la partie présente expérience de la calvaria a tous déjà été enlevés. Attention à ne pas supprimer complètement l'os temporal parce que les canaux de l'oreille devront être intacts pour placer la tête dans le cadre stéréotaxique. La question restante durée doit être retiré par le cerveau exposé. Le crâne est maintenant prêt à être placé dans le cadre stéréotaxique.
- De la même manière dans laquelle on pourrait procéder à une chirurgie stéréotaxique, ajuster l'œil, bouche, oreilles et bars tels que la tête est solidement fixée dans l'appareil de stéréotaxie. Placez le manipulateur stéréotaxique dans les coordonnées prédéterminées antérieur / postérieur (A / P) et déplacer le manipulateur à la face latérale du cerveau. Abaissez lentement la lame dans le cerveau, complètement soulever la lame du cerveau, puis déplacer dedans et abaisser la lame de nouveau. Répétez ces deux étapes jusqu'à ce que la lame a atteint la face latérale de l'hémisphère opposé. Ceci termine le premier bloc coronale. Pour ultérieures blocs coronale passer les 1cm manipulateur dans A / P axe et répéter jusqu'à ce que le cerveau entier a été bloqué.
Partie 3: Retrait du cerveau du crâne
- Retirer la tête du cadre stéréotaxique et maintenez le cerveau exposé dans la paume de votre main. Essayez de sécuriser le cerveau par une légère plaçant dorloter le cerveau dans la paume de votre main et placez votre petit doigt à travers le lobe frontal, ce mouvement minimise du cerveau dans le crâne. Afin d'éviter le séchage de la surface du cerveau piales, placez un morceau de gaze humidifié de PBS à travers le cerveau. Tenez fermement la tête par le crâne et les os ébrécher restantes occipital et temporal avec la colonne vertébrale. Cette situation expose les aspects de base et latérales du cerveau. Enfin enlever tout l'os frontal et reste l'os nasal, ce qui permettra l'accès vers les bulbes olfactifs. Il est important d'enlever l'os frontal dernière parce que vous retirez la base du crâne le cerveau se déplace légèrement et les lobes frontaux peut être endommagé sur les bords dentelés de l'os fontale. Couper et enlever la matière restante mère. Soulevez délicatement l'avant du cerveau, faites glisser le scalpel dans le cerveau et gratuitement le cerveau du crâne.
Partie 4: Mesures
- Il ya un certain nombre de mesures utiles qui peuvent être faites avant la congélation. Par exemple, l'A / P de l'axe du cerveau avec un étrier. Par ailleurs la densité spécifique peut être mesurée par la pesée du cerveau, mesure du volume par le déplacement de l'eau dans un cylindre gradué, puis en divisant le poids en déplacement de volume (tableau 1).
Partie 5: Fini le blocage du cerveau.
- En général, lorsque la lame du bistouri est inséré dans le cerveau, il n'est pas assez longue pour pénétrer complètement la pleine mesure dorsale-ventrale du cerveau. Une fois que le cerveau est prélevé et les mesures brutes sont obtenues, prendre un tissu à trancher la lame et la finition bloquant le cerveau par le biais de la face ventrale du cerveau (figure 2).
- Avant la congélation des blocs, il est nécessaire de cryoprotect le tissu classé solutions de saccharose PBS tamponné (10, 20 et 30%) maintenue à 4 ˚ C jusqu'à ce que les éviers cerveau. Il faut généralement une nuit d'incubation de 10%, 2-3 jours à 20% et 3-5 jours supplémentaires en 30% pour les blocs de couler au fond du récipient. Un changement quotidien des esolution e saccharose à 30% est recommandée.
Partie 6: Résultats Représentant
Il ya un certain nombre de mesures morphologiques brute qui peuvent être faites une fois que le cerveau a été retiré du crâne. Il s'agit notamment de longueur / P, le poids et la densité spécifique (tableau 1). Nous avons généralement bloquer le cerveau en mesurant 1 cm 6-7 blocs (figure 1). Chaque pièce est ensuite photographiée (figure 2) et peut encore être disséqué en fonction des besoins de recherche ou préparés pour la congélation des solutions de sucrose classés.
Sujet | A Longueur / P (Mm) | Poids (Grammes) | Déplacement d'eau (Ml) | Densité spécifique (G / ml) |
| O2303-2-1-1 | 64,3 | 28,1 | 24 | 1,171 |
| O5180-1 | 71,3 | 38,7 | 34 | 1,138 |
| O2708-3-1 | 62,8 | 28,7 | 26 | 1,104 |
| O9184-4-2 | 65,3 | 29,5 | 24 | 1,229 |
| N459-1-14-2 | 68,2 | 31,6 | 26 | 1,215 |
| MOYENNE | 66,38 | 31,32 | 26,8 | 1,171 |
| Ecart | 3,38 | 4,33 | 4,17 | 0,052 |
Tableau 1. Brut des mesures morphologiques de l'hémisphère droit de 5 mois vervets Vieux
Figure 1. Schémas pour les plans frontal utilisé pour bloquer le cerveau. Ceci est un exemple d'un cerveau adulte vervet externalisés. Exemple de la procédure de blocage. Les lignes verticales ici sont espacés de 1 cm, produisant typiquement 7 blocs coronale de chaque hémisphère.
Figure 2. Les blocs de tissu cérébral dans l'espace stéréotaxique. Chaque bloc donne environ 200 sections prises à 50 microns. Avec ce plan d'échantillonnage de plus de 1200 sections à travers le cortex seront prises et un montant supplémentaire de 400 à 500 du cervelet lors tranché dans le plan coronal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le Saint-Kitts-vervet (aethiops Chlorocebus sabeus) est un primate de l'Ancien Monde avec des motifs similaires et les taux de développement du cerveau cortical et sous-corticales à celui des humains. Cette espèce a été utilisé pour modéliser les troubles du comportement humain complexe comme un comportement anxieux, hypertension artérielle 8, 9 hémisphérectomie, la maladie de Parkinson 10, la maladie Alzhemier de 11, et l'abus d'alcool 12. Plus récemment, cette espèce a été utilisée pour étudier les effets neuro-anatomique de l'exposition prénatale éthanol naturalistes. Vervets enceintes ont été autorisés à boire de l'équivalent de 3-5 verres standard quatre fois par semaine pendant le troisième trimestre et nous le rapport qu'il ya une réduction de 35% des neurones dans le cortex frontal 13. Les cerveaux de cette étude ont été bloqués stéréotaxique de telle sorte que seulement 3 des 7 blocs nécessaires pour être sectionné pour compléter l'évaluation stéréologiques du cortex frontal. Cette technique particulière n'est pas limitée au cerveau des primates non humains, mais peut être étendu à des cerveaux de rongeurs ainsi. Par exemple, si le cortex somatosensoriel du rat est la région d'intérêt, une coupe stéréotaxique antérieures et postérieures à cette région peuvent être faites en utilisant le cadre stéréotaxique rongeurs. Cela donne une petite région à la section et d'un plan standard coronal entre les animaux. Il est important de noter que la lame doit être entièrement rétracté par le cerveau, avant tout mouvement médio-latérale est faite avec le manipulateur stéréotaxique sinon la lame non nécessairement endommager le cerveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito appui technique continu. Subvention du CRSNG au MP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | ||
| Tissue slicing blade | Thomas Scientific |
References
- Gallagher, M., Rapp, P. R. The use of animal models to study the effects of aging on cognition. Annu Rev Psychol 48. , 339-370 (1997).
- Clancy, B., Darlington, R., Finlay, B. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Nowakowski, R. S., Rakic, P. The site of origin and route and rate of migration of neurons to the hippocampal region of the rhesus monkey. J Comp Neurol. 196, 129-154 (1981).
- Rakic, P., Bourgeois, J. P., Eckenhoff, M. F., Zecevic, N., Goldman-Rakic, P. S. Concurrent overproduction of synapses in diverse regions of the primate cerebral cortex. Science. 232, 232-235 (1986).
- Granger, B., Tekaia, F., Le Sourd, A. M., Rakic, P., Bourgeois, J. P. Tempo of neurogenesis and synaptogenesis in the primate cingulate mesocortex: comparison with the neocortex. J Comp Neurol. 360, 363-376 (1995).
- Zecevic, N., Rakic, P. Development of layer I neurons in the primate cerebral cortex. J Neurosci. 21, 5607-5619 (2001).
- Ervin, F. R., Palmour, R. M., Young, S. N., Guzman-Flores, C., Juarez, J. Voluntary consumption of beverage alcohol by vervet monkeys: population screening, descriptive behavior and biochemical measures. Pharmacol Biochem Behav. 36, 367-373 (1990).
- Palmour, R. M., Mulligan, J., Howbert, J. J., Ervin, F. Of monkeys and men: vervets and the genetics of human-like behaviors. Am J Hum Genet. 61, 481-488 (1997).
- Boire, D., Théoret, H., Ptito, M. Stereological evaluation of neurons and glia in the monkey dorsal lateral geniculate nucleus following an early cerebral hemispherectomy. Exp Brain Res. 142, 208-220 (2002).
- Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Redmond, D. E. J. r, Elsworth, J. D., Roth, R. H., Cornelius, S. K., Snyder, E. Y., Sladek, J. R. Jr Human neural stem cells migrate along the nigrostriatal pathway in a primate model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 211, 362-369 (2008).
- Lemere, C. A., Beierschmitt, A., Iglesias, M., Spooner, E. T., Bloom, J. K., Leverone, J. F., Zheng, J. B., Seabrook, T. J., Louard, D., Li, D., Selkoe, D. J., Palmour, R. M., Ervin, F. R. Alzheimer's disease abeta vaccine reduces central nervous system abeta levels in a non-human primate, the Caribbean vervet. Am J Pathol. 165, 283-297 (2004).
- Mash, D. C., Staley, J. K., Doepel, F. M., Young, S. N., Ervin, F. R., Palmour, R. M. Altered dopamine transporter densities in alcohol-preferring vervet monkeys. Neuroreport. 7, 457-462 (1996).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
