Summary
गैर मानव प्राइमेट मस्तिष्क की सामान्य प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ के लिए एक महत्वपूर्ण translational प्रजातियों है. रहनुमा मस्तिष्क के संरचनात्मक संगठन को मनुष्यों में सामान्य और रोग की स्थिति में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
Abstract
गैर मानव प्राइमेट का उपयोग मानव में एक उत्कृष्ट विकास और उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ के लिए translational मॉडल प्रदान करता है
Protocol
भाग 1: पूर्व ऊतक के प्रसंस्करण
- टिश्यू अच्छी तरह से paraformaldehyde, glutaraldehyde, या formalin के साथ perfused होना चाहिए. यह मानक transcardial आमतौर पर अन्य अंगों की फसल के लिए इस्तेमाल किया छिड़काव के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. वर्तमान अध्ययन में विषय ketamine (10 मिग्रा / किग्रा, IM) हाइड्रोक्लोराइड, सोडियम pentobarbital (iv 25 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ अति euthanized के साथ गहराई से बेहोश किया गया था और 0.1 एम पीबीएस साथ transcardially perfused जब तक पूरी तरह से exsanguinated.This पीछा किया जाता है पीबीएस में 5 मिनट (~ 1 लीटर) के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान के द्वारा.
भाग 2: Stereotaxic अवरुद्ध
- Horsley-Clarke/interaural विमान शून्य के निर्देशांक stereotaxic फ्रेम में सिर रखने के लिए पहले किए जाने की जरूरत है. यह कान के बीच सैद्धांतिक मध्य है. इस विमान को मापने के लिए, कान सलाखों तंत्र में समान रूप से फिट होने की आवश्यकता है, तो stereotaxic जोड़तोड़ हाथ में एक स्केलपेल ब्लेड जगह है और कान सलाखों के बीच मध्य उपाय. यह जहां ऊतक ब्लॉक करने के लिए अनुसंधान की जरूरत के आधार पर निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है. एक बार यह पूरा हो गया है खोपड़ी stereotaxic तंत्र में निर्धारण के लिए तैयार रहना चाहिए.
- आदेश में stereotaxic फ्रेम में सिर जगह निचले जबड़े अस्थि rongeurs और एक स्केलपेल के साथ हटाया जाना होगा. इसके अलावा त्वचा, मांसपेशियों और संयोजी ऊतक के क्रम में खोपड़ी बेनकाब हटाया जाना चाहिए. एक बार संयोजी ऊतक खोपड़ी से निकाल दिया जाता है, दूर calvaria (पश्चकपाल हड्डी की तालिका भाग के रूप में अच्छी तरह के रूप में पार्श्विका, विज्ञापन ललाट हड्डियों) छिल द्वारा मस्तिष्क को बेनकाब. Calvaria की वर्तमान प्रयोग भाग में सभी के लिए तैयार हटा दिया गया है. सावधान रहो लौकिक हड्डियों को पूरी तरह निकाल नहीं है क्योंकि कान नहरों stereotaxic फ्रेम में सिर जगह बरकरार की आवश्यकता होगी. शेष dura मामला उजागर मस्तिष्क से हटा दिया जाना चाहिए. खोपड़ी अब stereotaxic फ्रेम में रखा जा करने के लिए तैयार है.
- एक ही तरीके जिसमें एक stereotaxic सर्जरी प्रदर्शन करेंगे, आंख, तालु, और कान ऐसी है कि सिर सुरक्षित stereotaxic तंत्र में तय हो गई है सलाखों समायोजित करें. पूर्व निर्धारित / पूर्वकाल पीछे (ए / पी) निर्देशांक और मस्तिष्क के पार्श्व पहलू पर ले जाने के जोड़तोड़ में stereotaxic जोड़तोड़ प्लेस. धीरे धीरे कम मस्तिष्क में ब्लेड, पूरी तरह से मस्तिष्क से ब्लेड बढ़ा, तो medially चाल और ब्लेड फिर से कम है. इन दो चरणों को दोहराएँ जब तक ब्लेड विपरीत गोलार्द्ध के पार्श्व पहलू पर पहुँच गया है. यह पहला राज्याभिषेक ब्लॉक पूरा करता है. बाद राज्याभिषेक ब्लॉक ए / पी अक्ष और दोहराने में जोड़तोड़ 1cm कदम जब तक पूरे मस्तिष्क अवरुद्ध किया गया है.
भाग 3: खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाना
- Stereotaxic फ्रेम से सिर निकालें और अपने हाथ की हथेली में उजागर मस्तिष्क पकड़. हल्के से अपने हाथ की हथेली में मस्तिष्क coddling रखने और ललाट lobes, खोपड़ी में मस्तिष्क के इस minimizes आंदोलन भर में अपनी कनिष्ठा उंगली जगह मस्तिष्क को सुरक्षित करने की कोशिश करो. आदेश में मस्तिष्क की pial सतह के सुखाने को रोकने के लिए जगह है, पीबीएस का एक टुकड़ा मस्तिष्क भर धुंध घटा. खोपड़ी और चिप स्पाइनल कॉलम के साथ साथ दूर शेष पश्चकपाल और लौकिक हड्डियों द्वारा मजबूती सिर पकड़ो. यह मस्तिष्क के आधार और पार्श्व पहलुओं को उजागर करता है. अन्त में किसी भी शेष ललाट की हड्डी और नाक की हड्डी है, जो घ्राण बल्ब का उपयोग करने की अनुमति देगा हटा दें. यह महत्वपूर्ण है ललाट हड्डी पिछले हटायें क्योंकि जैसा कि आप खोपड़ी के आधार हटायें मस्तिष्क थोड़ा चलता रहता है और ललाट lobes fontal हड्डी के दांतेदार किनारों पर क्षतिग्रस्त हो सकता है है. दूर कट और शेष dura बात हटायें. ध्यान से मस्तिष्क के सामने उठा, मस्तिष्क और खोपड़ी से मुक्त मस्तिष्क के तहत स्केलपेल स्लाइड.
भाग 4: माप
- वहाँ उपयोगी माप है कि ठंड के लिए पहले से बनाया जा सकता है है की एक संख्या हैं. उदाहरण के लिए, एक नली का व्यास के साथ मस्तिष्क के ए / पी अक्ष. इसके अलावा विशिष्ट घनत्व मस्तिष्क वजन द्वारा मापा जा सकता है, एक स्नातक की उपाधि प्राप्त की तो मात्रा विस्थापन (1 टेबल) द्वारा वजन विभाजित सिलेंडर में पानी के विस्थापन द्वारा की मात्रा को मापने के.
भाग 5: समाप्त मस्तिष्क अवरुद्ध.
- आमतौर पर जब स्केलपेल ब्लेड मस्तिष्क में डाला जाता है यह काफी लंबे समय के लिए पूरी तरह से मस्तिष्क के पूर्ण सीमा तक पृष्ठीय - वेंट्रल घुसना नहीं है. एक बार मस्तिष्क से हटा दिया है और सकल माप प्राप्त कर रहे हैं, एक ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया ब्लेड ले और मस्तिष्क के ventral पक्ष (चित्रा 2) के माध्यम से मस्तिष्क को अवरुद्ध खत्म.
- ब्लॉक ठंड से पहले, यह आवश्यक है वर्गीकृत PBS बफर sucrose के समाधान में ऊतक cryoprotect (10, 20, और 30%) 4 ˚ जब तक सी मस्तिष्क डूब पर बनाए रखा. यह आमतौर पर 10% में एक रात ऊष्मायन लेता है, 20% और कंटेनर के नीचे सिंक करने के लिए ब्लॉकों के लिए 30% में अतिरिक्त 3-5 दिन में 2-3 दिन. वें के एक दैनिक परिवर्तनई 30% sucrose के समाधान की सिफारिश की है.
भाग 6: प्रतिनिधि परिणाम
सकल रूपात्मक माप है कि एक बार मस्तिष्क खोपड़ी से हटा दिया गया है बनाया जा सकता है की एक संख्या हैं. इन ए / पी लंबाई, वजन, और विशिष्ट घनत्व (1 टेबल) शामिल हैं. हम आम तौर पर 6-7 ब्लॉक में 1cm (चित्रा 1) को मापने मस्तिष्क ब्लॉक. प्रत्येक टुकड़ा तो (चित्रा 2) फोटो खिंचवाने है और आगे अनुसंधान की जरूरत के आधार पर विच्छेदित कर सकते हैं या वर्गीकृत sucrose के समाधान में ठंड के लिए तैयार है.
विषय | एक पी / लंबाई (मिमी) | वज़न (ग्राम) | जल विस्थापन (एमएल) | विशिष्ट घनत्व (छ / मिलीलीटर) |
| O2303-2-1-1 | 64.3 | 28.1 | 24 | 1.171 |
| O5180 - 1 | 71.3 | 38.7 | 34 | 1.138 |
| O2708-3 - 1 | 62.8 | 28.7 | 26 | 1.104 |
| O9184-4-2 | 65.3 | 29.5 | 24 | 1.229 |
| N459-1-14-2 | 68.2 | 31.6 | 26 | 1.215 |
| AVERAGE | 66.38 | 31.32 | 26.8 | 1.171 |
| एसटीडी देव | 3.38 | 4.33 | 4.17 | 0.052 |
तालिका 1. 5 महीने पुरानी Vervets के दाएँ गोलार्द्ध के सकल morphological माप
चित्रा 1. राज्याभिषेक मस्तिष्क रोकने के लिए इस्तेमाल किया विमानों के लिए Schematics. यह एक externalized वयस्क vervet मस्तिष्क का एक उदाहरण है. अवरुद्ध प्रक्रिया का उदाहरण है. ऊर्ध्वाधर लाइनों यहाँ 1cm पर स्थान दिया गया है, आम तौर पर प्रत्येक गोलार्द्ध से 7 राज्याभिषेक ब्लॉक का निर्माण.
चित्रा 2. मस्तिष्क के ऊतकों के stereotaxic अंतरिक्ष में ब्लॉक. प्रत्येक ब्लॉक में लगभग 200 50μm पर लिया वर्गों निकलेगा . इस नमूने योजना के साथ प्रांतस्था के माध्यम से 1200 से अधिक वर्गों ले लिया जाएगा एक अतिरिक्त 400-500 सेरिबैलम से जब राज्याभिषेक विमान में कटा हुआ.
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Discussion
सेंट किट्स vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) समान पैटर्न और इंसानों की दर cortical और subcortical मस्तिष्क के विकास के साथ एक पुरानी दुनिया रहनुमा है. इस प्रजाति के लिए उत्सुक व्यवहार, उच्च रक्तचाप 8, 9 hemispherectomy, पार्किंसंस रोग, 10 Alzhemier 11 रोग, और शराब के 12 दुरुपयोग की तरह जटिल मानव व्यवहार विकारों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हाल ही में, इस प्रजाति के प्राकृतिक जन्म के पूर्व का इथेनॉल जोखिम का neuroanatomical प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. गर्भवती vervets तीसरी तिमाही के दौरान 3-5 मानक पेय चार बार एक सप्ताह के बराबर पीने की अनुमति दी गई है और हम रिपोर्ट है कि वहाँ ललाट प्रांतस्था 13 में न्यूरॉन्स की 35% की कमी है . इस अध्ययन के लिए दिमाग stereotaxically ऐसी है कि केवल 3 7 ब्लॉक ललाट प्रांतस्था का stereological मूल्यांकन पूरा sectioned की जरूरत अवरुद्ध किया गया. इस विशेष तकनीक गैर मानव प्राइमेट मस्तिष्क को सीमित नहीं है, लेकिन कृंतक दिमाग के लिए के रूप में अच्छी तरह से बढ़ाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अगर ब्याज की एक चूहे के somatosensory प्रांतस्था क्षेत्र है, एक stereotaxic पूर्वकाल और उस क्षेत्र के लिए पीछे काट कृंतक stereotaxic फ्रेम का उपयोग किया जा सकता है. इस अनुभाग में एक छोटे से क्षेत्र और पशुओं के बीच एक मानक राज्याभिषेक विमान प्रदान करता है. यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि ब्लेड पूरी तरह से मस्तिष्क से मुकर जाना चाहिए इससे पहले किसी भी औसत दर्जे का आंदोलन - पार्श्व stereotaxic जोड़तोड़ के साथ किया जाता है अन्यथा ब्लेड संयुक्त राष्ट्र जरूरी मस्तिष्क को नुकसान होगा.
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Acknowledgments
लेखकों Ikiel Ptito अपने निरंतर तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. NSERC सांसद के लिए अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | ||
| Tissue slicing blade | Thomas Scientific |
References
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