Summary
아닌 인간 영장류의 두뇌의 정상적인 처리에 대한 우리의 이해를위한 중요한 translational 수종입니다. 영장류 두뇌의 해부 학적 조직은 인간의 정상 및 병리 학적 조건에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Abstract
비 인간 영장류의 사용은 인간의 발달 및 노화 과정에 대한 우리의 이해를위한 훌륭한 translational 모델을 제공합니다
Protocol
1 부 : 조직의 사전 처리
- 조직은 잘 paraformaldehyde, 글루 타 알데히드, 또는 포르말린과 perfused해야합니다. 이것은 일반적으로 다른 장기를 수확하는 데 사용되는 표준 transcardial 재관류를 통해 달성될 수있다. 현재 연구에서 주제가 깊이 나트륨 pentobarbital (25 MG / kg, IV)의 과다로 euthanized 케타민을 하이드로 클로라이드 (10 MG / kg, IM)과 진정했고 완전히 exsanguinated.This 미행 때까지 0.1 M PBS로 transcardially perfused 5 분 (~ 1리터)을 PBS에 4 % paraformaldehyde 용액에 의해.
2 부 : Stereotaxic는 차단
- 이전 stereotaxic 프레임에 머리를 배치하는 Horsley-Clarke/interaural 비행기 제로의 좌표를 이동해야합니다. 이것은 귀 사이의 이론적 미드입니다. 이 비행기를 측정하려면, 귀 바 모두가 장치에 장착되어해야 다음 stereotaxic 조작하는 사람의 팔에 메스 블레이드를 배치하고 귀 막대 사이의 미드를 측정합니다. 이 연구의 필요에 따라 조직을 차단하는 위치를 결정하는 것이 중요합니다. 이것이 완료되면 두개골은 stereotaxic 장치로 고정을위한 준비를해야합니다.
- stereotaxic 프레임에 머리를 배치하기 위해 아래턱은 뼈 rongeurs와 메스로 제거해야합니다. 또한 피부, 근육 및 결합 조직은 두개골을 노출하기 위해 제거되어야합니다. 결합 조직은 두개골에서 제거되면, calvaria을 (후두 골의 표 부분뿐만 아니라 정수리, 광고 이마 뼈) 날 무시하여 뇌를 노출. calvaria의 현재 실험 부분에 모든 준비가 제거되었습니다. 귀 운하는 stereotaxic 프레임에 머리를 장소에 그대로 있어야 때문에 완전히 관자놀이 뼈를 제거하지 않도록주의하십시오. 나머지 두라의 문제가 노출 두뇌에서 제거되어야합니다. 두개골은 이제 stereotaxic 프레임에 배치 준비가되어 있습니다.
- 한 stereotaxic 수술을하는 것이 동일한 방식으로, 눈, 미각, 그리고 머리가 안전하게 stereotaxic 장치에서 해결 그러한 귀 막대를 조정합니다. 예정된 (A / P) 후부 / 앞쪽에 좌표에 stereotaxic 조작하는 사람을 놓고 두뇌의 측면으로 조작하는 사람을 이동합니다. 천천히, 두뇌에 날개를 낮은 완전히 두뇌의 칼날을 마련, 다음 medially 이동하고 다시 칼날을 낮추십시오. 날개가 반대 북반구의 측면에 도달하기 전까지는이 두 단계를 반복합니다. 이것은 첫 번째 코로나 블록을 완료합니다. 전체 두뇌가 차단되었습니다 때까지 후속 코로나 블록 / P 축과 반복에서 조작하는 사람의 1cm를 이동하십시오.
파트 3 : 두개골에서 뇌를 제거
- stereotaxic 프레임에서 머리를 제거하고 손바닥에 노출된 머리를 잡아. 가볍게 손바닥에 coddling 두뇌를 배치하고 이마 엽 (叶), 두개골에 뇌이 최소화 움직임에 걸쳐 새끼 손가락을 배치하여 두뇌를 확보하려고합니다. 두뇌의 pial 표면의 건조를 방지하기 위해, PBS의 일부가 뇌 전체 거즈를 dampened 놓으십시오. 단단히 척추 열의와 함께 두개골과 칩 거리에 남아있는 후두와 시간적 뼈의 머리를 잡아. 이것은 뇌의 바닥과 측면 측면을 제공합니다. 마지막으로 후각 구근에 대한 액세스를 허용하는 모든 나머지 이마 뼈와 코뼈가 골절을 제거합니다. 당신은 두개골의 기초를 제거할으로 두뇌가 약간 이동하고 이마 엽 (叶)이 fontal 뼈의 계단 모서리에 손상이 될 수 있기 때문에 마지막으로 전두엽 뼈를 제거하는 것이 중요합니다. 멀리 잘라 나머지 두라의 문제를 제거합니다. 신중하게, 두뇌의 전면을 리프트 두개골에서 두뇌 무료 두뇌에서 메스를 슬라이드.
4 부 : 측정
- 이전 동결로 만들 수있는 유용한 측정은 여러 가지가있을 수 있습니다. 예를 들어, 캘리퍼스로 두뇌의 A / P의 축. 또한 특정 밀도는 다음 볼륨 변위 (표 1) 체중을 나누어 눈금 실린더에 물을 변위에 의해 음량을 측정, 뇌의 무게로 측정할 수 있습니다.
제 5 부 : 마침이 머리를 차단.
- 일반적으로 메스 블레이드가 두뇌에 넣었을 때 그것은 완전히 두뇌의 전체 지느러미 - 복부 범위를 뚫을 수있을 정도 오래되지 않습니다. 두뇌가 제거되고 총 측정 취득되면 조직 깔끔히 칼날을 가지고 두뇌의 복부 측면 (그림 2)을 통해 뇌를 차단 마칩니다.
- 전에 블록을 냉동하기 위해서는 4 ˚ C까지 두뇌 싱크에서 유지 (10, 20, 그리고 30 %) 등급 PBS 버퍼 자당 솔루션의 조직을 cryoprotect 필요합니다. 그것은 일반적으로 20 % 2-3일 및 컨테이너의 하단에 싱크하는 블록에 대해 30 % 추가 3~5일 10 %에서 하룻밤 배양 걸립니다. 일의 일일 변화E 30 % 자당 솔루션을 권장합니다.
6 부 : 대표 결과
두뇌는 두개골에서 제거되었습니다 일단 만들 수 있습니다 총 형태학의 측정은 여러 가지가있을 수 있습니다. 이들은 A / P의 길이, 무게, 그리고 구체적인 밀도 (표 1)을 포함합니다. 우리는 일반적으로 1cm를 (그림 1) 측정 6-7 블록에 두뇌를 차단합니다. 각 조각은 다음 사진이다 (그림 2)와 추가 연구 필요에 따라 해부 또는 등급 자당 솔루션에 냉동 준비하실 수 있습니다.
제목 | A / P 길이 (㎜) | 무게 (g) | 워터 배기량 (ML) | 특정 밀도 (G / ML) |
| O2303 - 2 - 1 - 1 | 64.3 | 28.1 | 24 | 1.171 |
| O5180 - 1 | 71.3 | 38.7 | 34 | 1.138 |
| O2708 - 3 - 1 | 62.8 | 28.7 | 26 | 1.104 |
| O9184 - 4-2 | 65.3 | 29.5 | 24 | 1.229 |
| N459 - 1 - 14-2 | 68.2 | 31.6 | 26 | 1.215 |
| 평균 | 66.38 | 31.32 | 26.8 | 1.171 |
| STD DEV | 3.38 | 4.33 | 4.17 | 0.052 |
5 월 올드 Vervets의 오른쪽 뇌를 표 1. 그로스 형태학의 측정
그림 1. 두뇌를 차단에 사용되는 코로나 비행기에 대한 설계도. 이것은 externalized 성인 vervet 두뇌의 예입니다. 차단 절차의 예. 여기에 수직선은 일반적으로 각 반구에서 7 코로나 블록을 생산, 1cm의 간격입니다.
그림 2. stereotaxic 공간에서 뇌 조직의 블록. 각 블록은 50μm에서 찍은 약 200 섹션을 얻을 것입니다. 코로나 비행기에 얇게 때 샘플링 방식과 피질을 통해 무려 1200 쪽이 넘는 방대한 부분은 소뇌의 품을 추가로 400-500 것입니다.
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Discussion
세인트 키츠 vervet (Chlorocebus aethiops sabeus)은 인간의 대뇌 피질과 subcortical하는 두뇌 발달의 패턴과 유사한 속도로 올드 월드 영장류이다. 이 종 불안 행동, 고혈압 8 hemispherectomy 9, 파킨슨병 10 Alzhemier 병 11과 알코올 남용 12에게 같은 복잡한 인간의 행동 장애 증상을 모델로 사용되고 있습니다. 최근,이 수종은 자연 태아 에탄올 노출의 neuroanatomical 효과를 연구하기 위해 사용되었습니다. 임산부 vervets는 세 번째 임신 기간 중에는 3-5 표준 음료 4 번 씩에 해당 마시 허용하고 우리는 전두엽 피질 13 뉴런의 35 % 감소가있다는 것을보고했다. 본 연구에 대한 두뇌는 stereotaxically 불과 3 7 블록 전두엽 피질의 stereological 평가를 완료 sectioned 있어야만 이러한 차단되었습니다. 이것은 특정 기술이 아닌 인간 영장류 두뇌에 국한되지이며,뿐만 아니라 쥐 머리로 확장될 수 있습니다. 암흑의 somatosensory 피질 관심 지역의 경우 예를 들어, 해당 지역에 앞쪽에 및 사후 stereotaxic 상처가 쥐 stereotaxic 프레임을 사용하여 만들 수 있습니다. 이 섹션에 작은 지역과 동물 사이의 표준 코로나 비행기를 제공합니다. 모든 중간 - 측면 운동이 달리 날개가 해제 반드시 뇌 손상됩니다 stereotaxic 속이는 사람으로 만든되기 전에 블레이드가 완전히 두뇌에서 철회되어야함을하는 것이 중요합니다.
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Acknowledgments
저자는 자신의 지속적인 기술 지원 Ikiel Ptito 감사하고 싶습니다. MP에 NSERC 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | ||
| Tissue slicing blade | Thomas Scientific |
References
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