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Biology

ब्रेन बैंकिंग: अपने अनुसंधान नमूने के अधिकांश बनाना

doi: 10.3791/1260 Published: July 24, 2009

Summary

ब्रेन बैंकिंग और जैविक सामग्री के व्यवस्थित नमूने निष्पक्ष stereology के लिए आधार प्रदान करता है और संभावित प्रत्येक नमूना से प्राप्त आंकड़ों का अधिकतम है.

Abstract

निष्पक्ष stereology सही और कुशलता से ब्याज की एक दिए गए क्षेत्र में कुल न्यूरॉन संख्या (या अन्य कोशिका प्रकार) का आकलन करने के लिए एक विधि है

Protocol

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भाग 1: पूर्व ऊतक के प्रसंस्करण

  1. टिश्यू अच्छी तरह से paraformaldehyde, glutaraldehyde, या formalin के साथ perfused होना चाहिए. यह मानक transcardial आमतौर पर अन्य अंगों की फसल के लिए इस्तेमाल किया छिड़काव के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. अध्ययन में मौजूद विषय ketamine (10 मिग्रा / किग्रा, IM) हाइड्रोक्लोराइड, सोडियम pentobarbital (iv 25 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ अति euthanized के साथ गहरा बेहोश था और 0.1 एम पीबीएस साथ transcardially perfused जब तक पूरी तरह से exsanguinated. यह पीबीएस में 5 मिनट (~ 1 लीटर) के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान द्वारा पीछा किया जाता है.
  2. मस्तिष्क stereotaxically अवरुद्ध चाहिए खोपड़ी से हटा दिया, वजन, और मात्रा 2 निर्धारित किया है . ऊतक तो फॉस्फेट बफर में 30% sucrose के एक अंतिम एकाग्रता के साथ वर्गीकृत sucrose के समाधान में cryoprotected होना चाहिए. -65 ° सी में ऊतक के ब्लॉक तब isopentane में जमे हुए किया जा और -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस जब तक आप टुकड़ा के लिए तैयार हैं.

भाग 2: सिस्टमेटिक नमूनाकरण

  1. सिस्टमेटिक नमूने सेक्शनिंग करने के लिए पहले एक उचित योजना पर निर्भर करता है. दोनों व्याख्यान चबूतरे वाला दुम और पृष्ठीय - उदर विस्तार में रुचि के पूरे क्षेत्र में अच्छी तरह से परिभाषित किया जाना चाहिए. प्रयोग में प्रजातियों में से एक stereotaxic एटलस के हित के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए और ब्याज के क्षेत्र की लंबाई निर्धारित करने के लिए उपयोगी है. एक बार ब्याज के क्षेत्र की लंबाई यह नमूना अंतराल स्थापित करने के लिए आवश्यक है निर्धारित किया जाता है. उदाहरण के लिए, आप stereotaxic एटलस से तय है कि हित के क्षेत्र के पूरे हद तक rostro - पूंछ लंबाई में लगभग 3mm जब राज्याभिषेक विमान में सेक्शनिंग. फिर आप अनुभाग 50μm पर cryostat सेट, इस दर पर आप 60 वर्गों को कवर ब्याज के क्षेत्र की हद व्याख्यान चबूतरे वाला दुम होगा फैसला. एक ठेठ निष्पक्ष stereological अध्ययन के लिए 6-10 व्यवस्थित नमूना वर्गों विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. इस उदाहरण में 10 वर्गों को समान रूप से rostro दुम का 1 / 6 वर्गों के एक नमूना अंतराल में हद परिणाम भर दूरी.

भाग 3: मस्तिष्क बैंक के निर्माण

  1. एक बार अनुभाग नमूना आवृत्ति निर्धारित किया गया है, अगले कदम के लिए निर्धारित है जो दाग तुरंत प्रदर्शन किया जाएगा है. उदाहरण के लिए, यदि आप cresyl वायलेट के साथ धुंधला कर रहे हैं आप किसी स्लाइड पर 1 / 6 वर्गों कब्जा होगा. इस श्रृंखला 1 हो जाएगा. यदि आप वहाँ शायद कई संभावित एंटीबॉडी पता है कि आप करना चाहते हैं चलाने के लिए, लेकिन या तो डेटा देखना चाहते हैं कि आपके प्राथमिक दाग प्रदान करता है या बस immunohistochemistry प्रदर्शन का समय नहीं है, आदेश में वर्गों के शेष 5 सीरीज जगह वे कहते हैं कि कुओं युक्त प्रतिजन बनाए रखने के (1% polyvinyl pyrrolidone, 50% o.1M पीबीएस में ethylene glycol, 7.4 फोन) में कटा हुआ है . नीचे दी गई तालिका में एक नमूना एक स्लाइड और एक मस्तिष्क बैंक (1 टेबल) के भाग के रूप में वर्गों की एक प्लेट (मानक 48-अच्छी तरह से थाली) से मिलकर योजना प्रदान करता है.
    तालिका 1
    तालिका 1. अनुभाग नमूना आवृत्ति यहाँ 1 / 6 है. पहला खंड cresyl वायलेट धुंधला के लिए एक स्लाइड पर रखा गया है और अगले 5 वर्गों प्रतिजन में रखा जाता है संरक्षित. धारा संख्या 7 तब स्लाइड पर कब्जा कर लिया है और वर्गों 9-12 प्रतिजन में रखा जाता है संरक्षित. यह चक्र दोहराया है जब तक ब्याज या ऊतक के ब्लॉक के क्षेत्र exhaustively sectioned है.
  2. अगले कदम के ऊतक के exhaustively ब्लॉक अनुभाग है. चक पर मध्यम एम्बेड की एक छोटी राशि प्लेस और इसे फ्रीज. सूक्ष्म तक्षणी सिर में चक प्लेस और बंद जमी माध्यम से पर्याप्त के लिए एक फ्लैट सतह है दाढ़ी. सूक्ष्म तक्षणी सिर और cryostat के भीतर फ्लैट जगह से चक निकालें. चक पर मध्यम एम्बेड डालो और मजबूती stereotaxically कटौती चक पर तैनात साफ पक्ष के साथ मस्तिष्क ब्लॉक जगह. धीरे धीरे और पूरी तरह से से बढ़ते मध्यम मस्तिष्क में एम्बेड. सूक्ष्म तक्षणी सिर और अनुभाग अनुभाग नमूना आवृत्ति के लिए पूर्व निर्धारित मापदंडों का उपयोग करने में मस्तिष्क के साथ चक रखें.
  3. एक बार ऊतक के ब्लॉक exhaustively sectioned किया गया है और वर्गों कुओं में रखा जाता है, ढक्कन के साथ थाली कवर, parafilm साथ ढक्कन लपेटो करने के लिए, और एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जगह. प्रत्येक श्रृंखला, अनुभाग नमूने अंतराल है, और प्रत्येक जानवर के लिए श्रृंखला की संख्या के लिए उठाए गए अनुभागों की कुल संख्या प्रवेश करें. यह लॉग ट्रैक करने के लिए भविष्य immunohistochemistry के लिए वर्गों के बाद हटाने के मस्तिष्क बैंक से रखने के लिए महत्वपूर्ण होगा.

भाग 4: प्रतिनिधि परिणाम:

इस तरीके में व्यवस्थित नमूने हमारी प्रयोगशाला में पिछले 3 वर्षों के लिए एक मानक अभ्यास किया गया है. हम सफलता की सामग्री है कि प्रतिजन में संग्रहीत किया गया है तीन साल की रक्षा पर प्रदर्शन immunohistochemistry की एक महान सौदा किया है के बाद यह संकेत (चित्रा 1) की गिरावट के बिना कटा हुआ था. इसके अलावा, हमारे मस्तिष्क बैंक के हिस्से के रूप में हम गैर मानव के करीब 20,000 व्यवस्थित वर्गों लॉग इन किया हैरहनुमा मस्तिष्क हमारी लंबी अवधि के अनुसंधान की योजना के भाग के रूप में (चित्रा 2).

चित्रा 1. यह गैर मानव प्राइमेट के पश्चकपाल पोल से एक अनुभाग है NeuN लिए immunostained दोनों परत छठी और बीचवाला सफेद बात न्यूरॉन्स दिखा. इस विशेष अनुभाग प्रतिजन में संग्रहीत किया गया था -20 डिग्री सेल्सियस पर 2 साल की अवधि के लिए संरक्षित. स्केल बार = 100μm.

figure2
चित्रा 2 हमारे vervet मस्तिष्क बैंक अब 30 से अधिक बंदरों के करीब 20,000 व्यवस्थित वर्गों के होते हैं .

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Discussion

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सिस्टमैटिक नमूने एक सस्ती विधि शोध सामग्री को अधिकतम करने के लिए इरादा है. यह नमूना रणनीति निष्पक्ष stereology है कि पूरे क्षेत्र में व्यवस्थित नमूने की आवश्यकता के नियमों का पालन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक श्रृंखला के लिए वर्गों के क्रम को बनाए रखा है. हमारी प्रयोगशाला में हम सफलतापूर्वक दोनों हम्सटर और गैर मानव प्राइमेट मस्तिष्क वर्गों बैंकिंग के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया. अब तक, हम के करीब +२०,००० vervet बंदर (Chlorocebus aethiops sabeus) मस्तिष्क वर्गों एकत्र किया है और नियमित रूप से वर्गों है कि एक वर्ष से अधिक के लिए संग्रहित किया गया है पर immunohistochemisty प्रदर्शन. एक अच्छी तरह से विशेषता मस्तिष्क बैंक के लाभ के लिए धन निर्णय, नए छात्रों के लिए तेजी से डेटा एकत्रित करने की क्षमता है, और कम से कम उपयोग और नए जिससे अनुसंधान धन को अधिकतम पशुओं के उपचार के बीच डेटा एकत्रित करने की संभावना शामिल हैं.

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Acknowledgments

लेखकों Ikiel Ptito अपने निरंतर तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethylene glycol Fisher Scientific E178-4
Polyvinyl pyrrolidone Fisher Scientific BP431-500
Thermal Scientific Embedding Medium Fisher Scientific

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References

  1. West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
  2. Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. (2009).
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Burke, M. W., Zangenehpour, S., Ptito, M. Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens. J. Vis. Exp. (29), e1260, doi:10.3791/1260 (2009).More

Burke, M. W., Zangenehpour, S., Ptito, M. Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens. J. Vis. Exp. (29), e1260, doi:10.3791/1260 (2009).

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