Summary
Банковской мозга и систематический отбор биологического материала является основой для объективной стереологии и максимизирует потенциал данных, полученных от каждого образца.
Abstract
Объективное стереологии это метод точно и эффективно оценки общего количества нейронов (или другого типа клеток) в данной области интересов
Protocol
Часть 1: Предварительная обработка тканей
- Ткань должна быть хорошо озарен параформальдегида, глутаральдегида или формалина. Это может быть достигнуто с помощью стандартных transcardial перфузии обычно используется для сбора других органов. В настоящем исследовании тема глубоко седативные с кетамин гидрохлорид (10 мг / кг, внутримышечно), эвтаназии с передозировкой натрия фенобарбитала (25 мг / кг, внутривенно) и перфузии transcardially 0,1 М PBS пока полностью обескровлены. Далее следуют 4% параформальдегида решение в PBS в течение 5 мин (~ 1 литр).
- Мозг должен быть stereotaxically заблокированы, удалены из черепа, взвешивали, и объем определяется 2. Ткань должна быть cryoprotected в градуированных решения сахарозы с конечной концентрации 30% сахарозы в фосфатного буфера. Блоки ткани должны быть заморожены в изопентана при -65 ° С и хранить при температуре -80 ° С, пока вы не готовы срез.
Часть 2: Систематическая выборка
- Систематическая выборка зависит от надлежащего плана до секционирования. Всей области интереса в обоих ростральной-хвостовой и спинной-вентральной степени должны быть четко определены. Стереотаксической атлас видов использования полезно определить область интереса и определения длины области интересов. Как только длина области интереса определяется его необходимо установить интервал выборки. Например, из стереотаксического атласа вы определили, что весь rostro-каудальном степени интересующей области составляет приблизительно 3 мм в длину, когда секционирования в поперечной плоскости. Затем принять решение о создании криостата раздел на 50 мкм, при этом скорость у вас будет 60 разделов, охватывающих ростральной-каудальном протяженность области интересов. Для типичного беспристрастного исследования стереологического 6-10 систематически пробы разделы, необходимые для получения достоверных результатов. В этом примере 10 секций, равномерно распределенных по всему rostro-каудальном степени приведет к интервал выборки в 1 / 6 секций.
Часть 3: Создание мозга банка
- Как только частота раздела выборки был определен, следующим шагом будет определить, какие пятна будут выполнены немедленно. Например, если вы окрашивания крезиловый фиолетовый вы захватите 1 / 6 разделов на слайде. Это будет серия 1. Если вы знаете, там, может быть, несколько потенциальных антитела, которые вы хотели бы работать, но либо хотят видеть данные, которые ваша основная окраска предоставляет или просто не имеют времени для выполнения иммуногистохимии, место оставшиеся 5 ряда секций, в том порядке, что они были нарезанный в скважины содержащих антиген сохранения (1% поливинилпирролидона, 50% этиленгликоля в o.1M PBS, рН 7,4). В таблице ниже приведены схемы выборки, состоящей из 1 слайд и 1 пластина (стандартный 48-луночный планшет) сечений как часть мозга банка (табл. 1).
Таблица 1. Частота дискретизации раздел здесь 1 / 6. Первый раздел помещается на предметное стекло для окрашивания крезиловый фиолетовый и следующие 5 разделов помещаются в антиген сохранить. Раздел № 7, затем снятые на слайд и секций 9-12 помещаются в антиген сохранить. Этот цикл повторяется, пока область интереса или блока ткани исчерпывающе секционного. - Следующим шагом является исчерпывающим разделе блок ткани. Нанесите небольшое количество вложение среды на патрон и пусть все замерзнет. Место патрон в микротома голову и сбрить достаточное количество замороженных средних имеют плоскую поверхность. Удалите патрон от микротома головы и плоские места внутри криостата. Налейте вложение среды на патрон и прочно место мозга блок с stereotaxically разрезанной стороной расположен прямо на патроне. Медленно и полностью встроить в мозг монтаж среды. Место патрон с мозгом в микротома голову и секции, используя заранее определенные параметры для частоты дискретизации разделе.
- Как только блок ткани была исчерпывающе секционного и секции размещаются в колодцы, крышки пластинку с крышкой, завернуть крышку с парафильмом, и поместите в морозильник -20 ° C. Вход общее количество разделов приняты для каждой серии, раздел-интервал выборки, а количество серий для каждого животного. Этот журнал будет иметь жизненно важное значение для отслеживания последующее удаление разделов из мозга банк для будущих иммуногистохимии.
Часть 4: Представитель Результаты:
Систематический отбор проб таким образом была стандартная практика в нашей лаборатории за последние 3 года. Мы имели большой успех проведения иммуногистохимии на материале, который был сохранен в антиген сохранить три года после его нарезанный без ухудшения сигнала (рис. 1). Кроме того, как часть нашего мозга банк мы вошли близко к 20 000 систематических разделов не-человекамозга приматов (Рис. 2), как часть наших долгосрочных планов исследования. 
Рисунок 1. Это участок от затылочного полюса без человеческих приматов immunostained для Neun показывая и слой VI и интерстициальный белый нейронов вопрос. Данный раздел был сохранен в антиген сохранять при температуре -20 ° С в течение 2 лет. Шкала бар = 100 мкм. 
Рисунок 2. Vervet Наш банк мозг теперь состоит из близких к 20000 систематические разделы более чем из 30 обезьян.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Систематическая выборка недорогой метод предназначен для максимально исследования материала. Это стратегия выборки разработано в соответствии с правилами объективного стереологии, что требует систематического отбора проб во всем регионе. Очень важно, чтобы порядок разделов для каждой серии сохраняется. В нашей лаборатории мы успешно использовали этот метод для банковских и хомяка и не-человеческое приматов разделы мозга. До сих пор мы собрали близко к 20000 vervet обезьяны (Chlorocebus aethiops sabeus) участков мозга и регулярно выполнять immunohistochemisty на участках, которые были сохранены в течение года. Преимущества хорошо известных мозга банка включает возможность для сбора данных от решения о финансировании, способность для новых студентов, чтобы быстро собрать данные, и свести к минимуму использование и обработка новых животных тем самым максимально исследовательские фонды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Ikiel Ptito за его постоянную техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
