Summary
Bancário cérebro e amostragem sistemática de material biológico fornece a base para estereologia imparcial e maximiza o potencial de dados obtidos de cada espécime.
Abstract
Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em uma determinada área de interesse
Protocol
Parte 1: Pré-processamento de tecido
- Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro).
- O cérebro deve ser stereotaxically bloqueado, retirados do crânio, pesado, e volume determinado 2. O tecido deve então ser cryoprotected em soluções de sacarose classificados com uma concentração final de sacarose 30% em tampão fosfato. Blocos de tecido deve então ser congelados em isopentano a -65 ° C e armazenadas a -80 ° C até que esteja pronto para cortar.
Parte 2: Amostragem Sistemática
- Amostragem sistemática depende de um bom plano antes do corte. Toda a região de interesse, tanto as extensões rostral-caudal e dorso-ventral devem ser bem definidos. Um atlas estereotáxico das espécies em uso é útil para definir a região de interesse e para determinar o comprimento da região de interesse. Uma vez que o comprimento da região de interesse é determinado, é necessário estabelecer o intervalo de amostragem. Por exemplo, desde o atlas estereotáxico-lo a determinar que a extensão rostro-caudal total da região de interesse é de aproximadamente 3 milímetros de comprimento quando o corte no plano coronal. Você, então, decidir o criostato a seção de 50 ìm, a este ritmo, terá 60 seções que cobrem a extensão rostral-caudal da região de interesse. Para um estudo imparcial típico estereológica 10/06 seções sistematicamente amostradas são necessários para obter resultados confiáveis. Neste exemplo, 10 seções igualmente espaçados ao longo do resultado extensão rostro-caudal em um intervalo de amostragem de 1 / 6 seções.
Parte 3: Criação do banco de cérebros
- Uma vez que a frequência de amostragem foi determinada seção, o próximo passo é determinar quais as manchas serão realizados imediatamente. Por exemplo, se você estiver com coloração violeta cresil você irá capturar 06/01 seções em um slide. Esta será uma série. Se você sabe que há talvez vários anticorpos potencial que você gostaria de correr, mas tanto quer ver os dados que o seu principal fornece mancha ou simplesmente não têm o tempo para realizar a imuno-histoquímica, coloque o restante da série 5 seções na ordem em que eles foram cortados em poços preservar antígeno contendo (1 polivinil pirrolidona%, etileno glicol 50% em o.1M PBS, pH 7,4). A tabela abaixo fornece um sistema de amostragem composta por uma lâmina e uma placa (placa de 48 bem-padrão) de seções como parte de um banco de cérebros (Tabela 1).
Tabela 1. A freqüência de amostragem seção aqui é 06/01. A primeira seção é colocado sobre uma lâmina para coloração violeta cresil e os próximos 5 seções são colocados em antígeno preservar. Número da seção 7 é então capturado no slide e seções 9-12 são colocados em antígeno preservar. Este ciclo é repetido até que a região de interesse ou bloco de tecido é exaustivamente seccionado. - O próximo passo é exaustivamente seção do bloco de tecido. Coloque uma pequena quantidade de incorporação de média no mandril e deixá-lo congelar. Coloque o chuck na cabeça micrótomo e raspar o suficiente do meio de congelados para ter uma superfície plana. Remova o mandril da cabeça do micrótomo e local plano dentro do criostato. Despeje sobre a incorporação de médio chuck e firmemente colocar o bloco do cérebro com o lado stereotaxically corte posicionado categoricamente sobre o mandril. Lentamente e completamente incorporar o cérebro no meio de montagem. Coloque o chuck com o cérebro na cabeça do micrótomo e seção usando os parâmetros pré-determinados para a frequência de amostragem seção.
- Assim que o bloco de tecido tem sido exaustivamente seccionados e as secções são colocadas em poços, cobrir a placa com a tampa, envolva a tampa com parafilme, e colocar em um freezer -20 C °. Registrar o número total de seções tomadas para cada série, o intervalo de seção de amostragem, eo número de série para cada animal. Este log será vital para manter o controle de posterior remoção de seções do banco de cérebros para imunohistoquímica futuro.
Parte 4: Resultados Representante:
Amostragem sistemática desta maneira tem sido uma prática comum em nosso laboratório durante os últimos três anos. Tivemos um grande sucesso da imuno-histoquímica desempenho no material que foi armazenado em antígeno preservar três anos depois que foi cortada, sem deterioração do sinal (Figura 1). Além disso, como parte do nosso banco de cérebros, temos registrados cerca de 20.000 seções sistemática da não-humanosprimata cérebro (Figura 2) como parte de nossos planos de investigação a longo prazo. 
Figura 1. Esta é uma seção do pólo occipital do primata não-humano histoquímica para NeuN mostrando tanto a camada VI e intersticial neurônios da substância branca. Esta seção especial foi armazenado em antígeno preservar a -20 ° C por um período de dois anos. Barra de escala = 100μm. 
Figura 2. Nosso banco de cérebros vervet agora consiste de cerca de 20 mil seções sistemática de mais de 30 macacos.
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Discussion
Amostragem sistemática é um método barato pretende maximizar material de pesquisa. Esta estratégia de amostragem foi desenvolvido em conformidade com a legislação de estereologia imparcial que requer amostragem sistemática em toda a região. É fundamental que a ordem das secções para cada série é mantida. Em nosso laboratório temos utilizado com sucesso este método para operações bancárias tanto hamster e não-humanos seções cérebro dos primatas. Até agora, nós coletamos seções cérebro perto de 20 mil macacos vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) e rotineiramente immunohistochemisty em seções que foram armazenados por mais de um ano. Os benefícios de um banco de cérebros bem caracterizados incluem a possibilidade de coletar dados entre decisões de financiamento, a capacidade para novos alunos para coletar dados rapidamente, e minimizar o uso e tratamento de novos animais maximizando fundos de pesquisa.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu contínuo apoio técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
