Summary
Beyin bankacılık ve biyolojik materyalin sistematik örnekleme tarafsız stereology temelini sağlar ve olası veri her numune elde edilen en üst düzeye çıkarır.
Abstract
Hakkında tarafsız stereology, doğru ve etkili bir şekilde belirli bir ilgi alanında toplam nöron sayısı (ya da diğer hücre tipi) tahmin etmek için bir yöntemdir
Protocol
Bölüm 1: Ön-işleme doku
- Doku paraformaldehid, glutaraldehid, ya da formalin ile perfüze edilmelidir. Bu, genellikle diğer organlarda hasat için kullanılan standart transcardial perfüzyon yoluyla elde edilebilir. Bu çalışmada bu konuda derin sodyum pentobarbital (25 mg / kg, iv), aşırı dozda ötenazi ketamin hidroklorür (10 mg / kg, im), sedasyon ve tamamen exsanguinated kadar 0.1 M PBS ile transcardially perfüze. Bu 5 dakika (~ 1 litre) PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile takip edilmektedir.
- Beyin stereotaxically, bloke kafatası çıkarılır, tartılır ve hacmi 2 tespit edilmelidir. Daha sonra doku fosfat tampon% 30 sakaroz nihai bir konsantrasyon ile kademeli sakaroz çözümleri cryoprotected olmalıdır. Daha sonra doku blokları isopentane -65 ° C'de dondurulmuş ve -80 saklanan ° C dilim için hazır olana kadar.
Bölüm 2: Sistematik Örnekleme
- Sistematik örnekleme kesit için önce uygun bir plan dayanmaktadır. Rostral-kaudal ve dorsal-ventral kapsam hem de ilgi tüm bölgeyi iyi tanımlanmış olmalıdır. Kullanım türlerinin stereotaksik atlas, ilgi bölgeyi tanımlamak için ve ilgi bölgenin uzunluğunu belirlemek için yararlı olacaktır. Bir kez faiz bölgenin uzunluğu, örnekleme aralığı kurmak için gerekli belirlenir. Örneğin, stereotaksik atlas koronal planda kesit ilgi, bölgenin tüm postero-kaudal ölçüde uzunluğu yaklaşık 3mm olup olmadığını belirlemek. Daha sonra, 50μm bölümüne Kriyostat ayarlamak için bu oran az ilgi bölgenin rostral-kaudal ölçüde kapsayan 60 bölümden olacak karar verin. Tipik bir tarafsız stereolojik çalışma için sistematik olarak örneklenmiş 6-10 bölümleri güvenilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bu örnekte 10 bölüm, 1 / 6 bölümden bir örnekleme aralığı postero-kaudal ölçüde sonucu eşit yayılıyor.
Bölüm 3: beyin bankası oluşturulması
- Bölümde örnekleme frekansı tespit edildikten sonra, bir sonraki adıma lekeleri hemen yapılacaktır hangi belirlemektir. Örneğin, cresyl menekşe ile boyanarak eğer bir slayt 1 / 6 bölümler yakalayacaktır. Bu seri, 1 olacak. Size istediğiniz belki birkaç potansiyel antikorları var biliyorsanız çalışır, ama ya birincil leke sağlar ya da sadece immünohistokimya gerçekleştirmek için zaman yok, sipariş bölümden kalan 5 serisi yerde verileri görmek istiyorum. kuyuları antijen korumayı içeren (% 1 polivinil pirolidon, o.1M PBS içinde% 50 etilen glikol, Ph 7.4) içine dilimlenmiş. Aşağıdaki tablo, 1 slayt ve 1 tabak (standart 48-iyi plaka) bir beyin bankası (Tablo 1) bir parçası olarak bölümden oluşan bir örnekleme planı sağlar.
Tablo 1: Burada bölümde örnekleme frekansı 1 / 6 'dır. İlk bölüm cresyl menekşe boyama için bir slayt yerleştirilir ve önümüzdeki 5 bölümden korumak antijeni yerleştirilir. Bölüm 7 numaralı slaytta yakalanır ve bölümleri 9-12 korumak antijen konur. Bu döngü, faiz veya doku blok bölgedeki ince ayrıntısına kadar kesitli kadar tekrarlanır. - Bir sonraki adım ince ayrıntısına kadar bölüm doku blok. Mandren, orta gömme küçük bir miktar yerleştirin ve donmasına izin. Mandreni mikrotom baş koyun ve düz bir yüzeye sahip dondurulmuş orta yeterince traş. Kriyostat içinde mikrotom baş ve düz bir yerde mandreni çıkarın. Mandren, orta gömme dökün ve sıkıca mandreni üzerine yatay olarak yerleştirilmiş stereotaxically kesilmiş tarafı ile beyin blok yerleştirin. Yavaş ve tamamen montaj orta beyin gömün. Mikrotom baş ve bölüm bölüm örnekleme frekansı için önceden belirlenmiş parametreler kullanılarak beynin mandreni yerleştirin.
- Doku blok ince ayrıntısına kadar kesitli ve bölümleri kuyular içine yerleştirildikten sonra, kapak ile plaka kapağı ile kapağı sarmak parafilm, ve -20 ° C derin dondurucuya yerleştirin. Toplam sayısı, her bir dizi bölümü örnekleme aralığı, her bir hayvan için dizi sayısı için alınan bölümden giriş yapın. Bu günlük, gelecekte immünohistokimya beyin banka bölümlerin sonradan giderilmesi takip etmek için önemli olacaktır.
Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları:
Sistematik örnekleme bu şekilde son 3 yıldır laboratuvarda standart bir uygulama olmuştur. Sinyal bozulması olmadan (Şekil 1) dilimlenmiş sonra malzeme üzerinde üç yıl muhafaza antijen kayıtlı olan başarılı performans immünohistokimya büyük bir anlaşma yaptık. Ayrıca, beynimizin banka bir parçası olarak biz yaklaşık 20.000 insan olmayan sistematik bölümleri oturum açmışprimat beyin, bizim uzun vadeli araştırma planlarının parçası olarak (Şekil 2). 
1. Bu insan dışı primat oksipital kutuplu bir bölümü Şekil katmanı VI ve interstisyel beyaz cevher nöronlar hem gösteren Neun immunohistokimyasal. Bu özel bölümde, 2 yıllık bir süre için -20 ° C'de muhafaza antijen depolandı. Ölçek çubuğu = 100μm. 
Şekil 2 vervet beyin bankası, 30 yılı aşkın maymunlardan yaklaşık 20.000 sistematik bölümden oluşur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sistematik örnekleme, araştırma malzemesi en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmış ucuz bir yöntem. Bu örnekleme stratejisinin bölge genelinde sistematik örnekleme gerektirir tarafsız stereology kurallarına uyacak şekilde tasarlanmıştır. Bu, her dizi için bölümlerin sırasını muhafaza olduğunu kritik öneme sahiptir. Laboratuarımızda başarıyla hamster ve insan dışı primat beyin bölümlerde her iki banka için bu yöntemi kullanmıştır. Şimdiye kadar, yaklaşık 20.000 vervet maymun (Chlorocebus aethiops sabeus) beynin bölümleri topladık ve rutin bir yıl boyunca saklanan bölümlerde immunohistochemisty gerçekleştirmek. Iyi karakterize beyin banka faydaların finansman kararları hızlı bir şekilde veri toplamak için yeni öğrenciler için yeteneği ve böylece araştırma fonlarının maksimize yeni hayvan kullanımı ve tedavi en aza indirmek arasında veri toplamak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Ikiel Ptito onun devam eden teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
