Summary
Banche del cervello e campionatura sistematica di materiale biologico costituisce la base per stereologia imparziale e massimizza il potenziale dei dati ottenuti da ogni campione.
Abstract
Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in una data area di interesse
Protocol
Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti
- Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro).
- Il cervello deve essere stereotaxically bloccato, rimosso dal cranio, pesato, e il volume determinato 2. Il tessuto deve quindi essere crioprotetti in soluzioni di saccarosio classificato con una concentrazione finale di 30% di saccarosio in tampone fosfato. Blocchi di tessuto deve essere congelato in isopentano a -65 ° C e conservati a -80 ° C fino a quando si è pronti a fetta.
Parte 2: campionamento sistematico
- Campionamento sistematico si basa su un piano adeguato prima di sezionamento. L'intera regione di interesse in entrambe le estensioni rostrale-caudale e dorso-ventrale deve essere ben definito. Un atlante stereotassico delle specie in uso è utile per definire la regione di interesse e per determinare la lunghezza della regione di interesse. Una volta che la lunghezza della regione di interesse è determinato, è necessario stabilire l'intervallo di campionamento. Per esempio, dal atlante stereotassico si stabilisce che l'intero rostro-caudale estensione della regione di interesse è di circa tre millimetri di lunghezza Durante il taglio nel piano coronale. Quindi decide di impostare il criostato alla sezione a 50 micron, di questo passo si avrà 60 sezioni che coprono il rostrale-caudale estensione della regione di interesse. Per un tipico studio imparziale stereological 6-10 sezioni sistematicamente campioni sono necessari per ottenere risultati attendibili. In questo esempio 10 sezioni equidistanti in tutto il rostro-caudale risultato misura in un intervallo di campionamento di 1 / 6 sezioni.
Parte 3: Creazione della banca del cervello
- Una volta che la frequenza di campionamento sezione è stato determinato, il passo successivo è quello di determinare che le macchie verrà eseguita immediatamente. Per esempio, se siete colorazione con violetto cresolo potrete catturare 1 / 6 sezioni su una diapositiva. Questo sarà serie 1. Se sai che forse diversi anticorpi potenziale che si desidera eseguire, ma entrambi vogliono vedere i dati che fornisce il vostro principale macchia o semplicemente non hanno il tempo per eseguire l'immunoistochimica, posto il restante 5 serie di sezioni nell'ordine in cui sono sono stati tagliati a preservare pozzetti contenenti antigeni (1 pirrolidone polivinile%, glicole etilenico al 50% in o.1M PBS, pH 7,4). La seguente tabella fornisce uno schema di campionamento composto da 1 scivolo e 1 piastra (standard piastra da 48 pozzetti) di sezioni come parte di una banca del cervello (Tabella 1).
Tabella 1. La frequenza di campionamento sezione qui è 1 / 6. La prima sezione è posto su un vetrino per la colorazione violetto cresolo e il prossimo 5 sezioni sono poste in antigene preservare. Numero della sezione 7 è poi catturato sulla diapositiva e le sezioni 9-12 sono collocati in antigene preservare. Questo ciclo viene ripetuto fino a quando la regione di interesse o il blocco dei tessuti è esaustivo sezionato. - Il passo successivo è quello di sezione esaurientemente il blocco di tessuto. Mettere una piccola quantità di incorporare medio sul mandrino e farlo congelare. Posizionare il mandrino nella testa microtomo e radere abbastanza del mezzo congelato di avere una superficie piana. Rimuovere il mandrino dalla testa microtomo e luogo pianeggiante all'interno del criostato. Versare incorporare medio sul mandrino e saldamente posto il blocco cervello con il lato stereotaxically taglio posizionato categoricamente sul mandrino. Incorporare lentamente e completamente il cervello in montaggio di media. Posizionare il mandrino con il cervello nella testa microtomo e la sezione con il pre-determinati parametri per la frequenza di campionamento sezione.
- Una volta che il blocco di tessuto è stata esaurientemente sezionato e le sezioni sono collocati in pozzi, coprire la piastra con il coperchio, avvolgere il coperchio con parafilm, e mettere in un congelatore di -20 ° C. Registro il numero totale delle sezioni adottate per ciascuna serie, la sezione-intervallo di campionamento, e il numero di serie per ogni animale. Questo registro sarà vitale per tenere traccia di successiva rimozione di sezioni dalla banca cervello per immunoistochimica futuro.
Parte 4: Risultati Rappresentante:
Campionamento sistematico in questo modo è stata una pratica standard nel nostro laboratorio negli ultimi 3 anni. Abbiamo avuto un grande successo di immunoistochimica eseguire sul materiale che è stata conservata in antigene preservare tre anni dopo è stato tagliato senza deterioramento del segnale (Figura 1). Inoltre, come parte della nostra banca cervello che abbiamo registrato vicino a 20.000 sezioni sistematica della non-umanocervello dei primati (Figura 2) come parte della nostra piani a lungo termine della ricerca. 
Figura 1. Questa è una sezione dal polo occipitale del primate non umano immunostained per NeuN mostrando sia VI livello e interstiziale neuroni della sostanza bianca. Questa particolare sezione è stato immagazzinato in antigene conservare a -20 ° C per un periodo di 2 anni. Barra di scala = 100μm. 
Figura 2. La nostra banca cervello cercopiteco ora è composta di quasi 20.000 sezioni sistematico da oltre 30 scimmie.
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Discussion
Campionamento sistematico è un metodo poco costoso scopo di massimizzare il materiale di ricerca. Questa strategia di campionamento è stato progettato per rispettare le regole di stereologia imparziale che richiede il campionamento sistematico in tutta la regione. E 'fondamentale che l'ordine delle sezioni per ogni serie è mantenuta. Nel nostro laboratorio abbiamo utilizzato con successo questo metodo per il settore bancario sia criceto e non umani sezioni cervello dei primati. Finora abbiamo raccolto sezioni cervello vicino a 20.000 scimmia cercopiteco (Chlorocebus aethiops sabeus) ed eseguire di routine immunohistochemisty sulle sezioni che sono stati conservati per oltre un anno. I vantaggi di un ben caratterizzato banca cervello includono la possibilità di raccogliere dati tra decisioni di finanziamento, la capacità per i nuovi studenti di raccogliere velocemente i dati e minimizzare l'uso e il trattamento di nuovi animali in modo da massimizzare fondi per la ricerca.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
