الخدمات المصرفية للدماغ : جعل معظم العينات بحوث الخاص

Summary

الدماغ المصرفي وأخذ العينات من المواد البيولوجية المنهجي يوفر الأساس لالتجسيم غير منحازة ويزيد من إمكانية الحصول على بيانات من كل عينة.

Abstract

التجسيم هو أسلوب غير متحيز لبدقة وكفاءة تقدير عدد الخلايا العصبية الكلي (أو غيرها من نوع من الخلايا) في مجال معين من مجالات الاهتمام

Protocol

الجزء 1 : قبل معالجة الأنسجة

1. وينبغي أن الأنسجة perfused جيدا مع بارافورمالدهيد ، غلوتارالدهيد ، أو الفورمالين. ويمكن تحقيق ذلك من خلال نضح transcardial القياسية المستخدمة عادة لحصاد الأجهزة الأخرى. في هذه الدراسة كان مخدرا بعمق هذا الموضوع مع هيدروكلوريد الكيتامين (10 ملغم / كغم ، IM) ، الموت الرحيم مع جرعة زائدة من (الرابع 25 ملغ / كلغ ،) والصوديوم بنتوباربيتال perfused transcardially مع PBS 0،1 M حتى exsanguinated تماما. ويعقب ذلك من خلال حل بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق (~ 1 ليتر).
2. وينبغي حظر stereotaxically الدماغ ، إزالتها من الجمجمة ، وزنه ، وتحديد حجم ^2. ثم ينبغي أن يكون النسيج cryoprotected في حلول السكروز متدرج مع تركيز النهائي من السكروز 30 ٪ في العازلة الفوسفات. ثم ينبغي أن تكون كتل من الأنسجة المجمدة في isopentane عند درجة -65 وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تكون على استعداد لشريحة.

الجزء 2 : المعاينة المنتظمة

1. أخذ العينات بطريقة منهجية تعتمد على خطة ملائمة قبل sectioning. ينبغي أن تكون المنطقة بأسرها من الاهتمام في كل من منقاري بدرجات - الذيلية والظهرية البطنية محددة جيدا. أطلس التجسيمي من الأنواع المستخدمة هي مفيدة لتحديد المصالح والمنطقة لتحديد طول المنطقة من الفائدة. مرة واحدة يتم تحديد طول المنطقة من الفائدة من الضروري إنشاء فاصل أخذ العينات. على سبيل المثال ، من الأطلس التجسيمي يمكنك تحديد ذلك كله rostro - الذيلية مدى الفائدة على هذه المنطقة 3mm تقريبا في الطول عند sectioning في الطائرة الاكليلية. ثم عليك أن تقرر تعيين ناظم البرد إلى الباب في 50μm ، على هذا المعدل سيكون لديك 60 أقسام تغطي مدى منقاري - الذيلية في المنطقة من الفائدة. لدراسة نموذجية stereological غير منحازة مطلوبة 60-10 المقاطع عينات بانتظام للحصول على نتائج موثوقة. في هذا المثال 10 أقسام متباعدة بالتساوي في جميع أنحاء النتيجة مدى rostro - الذيلية في فاصل زمني أخذ العينات من 1 / 6 أقسام.

الجزء 3 : إنشاء المصرف الدماغ

1. مرة واحدة وقد تم تحديد وتيرة أخذ العينات الباب ، فإن الخطوة التالية هي تحديد ما الذي سيتم تنفيذه على الفور البقع. على سبيل المثال ، إذا كنت تلطيخ مع البنفسجي cresyl سوف التقاط 06/01 المقاطع على شريحة. وسوف تكون هذه السلسلة 1. إذا كنت أعرف أن هناك العديد من الأجسام المضادة ربما المحتملة التي تريد تشغيل ، ولكن نريد أن نرى أي من البيانات التي تقدم الخاص صمة الابتدائي أو ببساطة لا يملكون الوقت الكافي لتنفيذ المناعية ، ومكان ما تبقى من 5 سلسلة من المقاطع في الترتيب الذي وكانت شرائح في الحفاظ على الآبار التي تحتوي على مستضد (1 pyrrolidone البولي فينيل ٪ و 50 ٪ جلايكول الإثيلين في برنامج تلفزيوني o.1M ، فتاه 7.4). الجدول أدناه مخطط أخذ العينات التي تتألف من شريحة 1 و 1 لوحة (لوحة القياسية 48 أيضا) من أبواب كجزء من البنك الدماغ (الجدول 1).
   
   الجدول 1. تواتر أخذ العينات المقطع هنا هو 1 / 6. يوضع القسم الأول على شريحة لتلطيخ cresyl البنفسج وتوضع المقبل الى 5 أقسام مستضد الحفاظ عليها. ثم يتم التقاط رقم الباب 7 على الشريحة ، والأبواب 9-12 يتم وضعها في الحفاظ على المستضد. وتتكرر هذه الدورة حتى منطقة الفائدة أو كتلة من الأنسجة غير مقطوع شامل.
2. الخطوة التالية هي الفرع باستفاضة كتلة من الأنسجة. ضع كمية صغيرة من تضمين المتوسطة في تشوك والسماح لها التجميد. ضع تشوك في الرأس ويحلق مشراح ما يكفي من المتوسط ​​المجمدة لديها سطح مستو. إزالة تشوك من رئيس مشراح ومكان داخل شقة ناظم البرد. من أجل تضمين المتوسطة في مكان وتشاك بشدة كتلة الدماغ مع الجانب قطع stereotaxically المتمركزة بشكل قاطع على تشاك. تضمين ببطء وبشكل كامل في تركيب الدماغ المتوسط. ضع تشوك مع الدماغ في الرأس والجزء مشراح باستخدام المعلمات محددة مسبقا للمقطع تردد أخذ العينات.
3. مرة واحدة في كتلة من الأنسجة تم مقطوع شامل وتوضع في آبار المقاطع ، وغطاء لوحة مع غطاء ، غطاء التفاف مع parafilm ، ووضع في الثلاجة -20 درجة مئوية. سجل إجمالي عدد الفروع لكل اتخذت سلسلة الفاصل مقطع أخذ العينات ، وعدد سلسلة لكل حيوان. هذا السجل سوف تكون حيوية للحفاظ على تعقب من إزالة أجزاء لاحقة من البنك لالمناعية في المخ في المستقبل.

الجزء 4 : النتائج الممثل :

وقد تم أخذ عينات نظامية في هذه الطريقة من الممارسات المعتادة في المختبر لدينا على مدى السنوات ال 3 الماضية. كان لدينا قدرا كبيرا من النجاح المناعية على أداء المواد التي تم تخزينها في الحفاظ على مستضد بعد ثلاث سنوات من شرائح دون تدهور إشارة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك ، وكجزء من البنك الدماغ لدينا تسجيل ونحن على مقربة من 20000 المقاطع المنهجي للإنسان غيرالرئيسيات الدماغ (الشكل 2) كجزء من خططنا البحثية الطويلة الأجل.

immunostained الرقم 1 ، وهذا القسم من القطب القذالي من الرئيسيات غير البشرية لكلا السادس NeuN تظهر طبقة الخلايا العصبية وخلالي المادة البيضاء. تم تخزين هذا القسم خاص في الحفاظ على مستضد -20 درجة مئوية لمدة 2 سنة. مقياس شريط = 100μm.


الشكل 2. مصرفنا الفرفت المخ يتكون الآن ما يقرب من 20000 من أقسام منهجية أكثر من 30 القرود.

Discussion

العينة المنتظمة وسيلة غير مكلفة تهدف إلى تحقيق أقصى قدر من المواد البحثية. تم تصميم هذه الاستراتيجية أخذ العينات للامتثال لقواعد التجسيم غير متحيزة التي تتطلب أخذ عينات منتظمة في جميع أنحاء المنطقة. فمن الأهمية بمكان أن يتم الحفاظ على نظام الفروع لكل السلسلة. في المختبر لدينا استخدمنا بنجاح هذا الأسلوب على حد سواء للأعمال المصرفية الهامستر وغير البشرية أقسام الدماغ الرئيسيات. حتى الآن ، وقد جمعنا أجزاء الدماغ على مقربة من 20000 قرد الفرفت (Chlorocebus aethiops sabeus) وأداء روتيني immunohistochemisty على المقاطع التي تم تخزينها لمدة تزيد على السنة. فوائد البنوك جيدا يتميز الدماغ بما في ذلك إمكانية لجمع البيانات بين قرارات التمويل ، والقدرة للطلاب الجدد بسرعة لجمع البيانات ، والتقليل من استخدام ومعاملة حيوانات جديدة وبالتالي تحقيق أقصى قدر من الأموال المخصصة للبحث.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethylene glycol	Fisher Scientific	E178-4
Polyvinyl pyrrolidone	Fisher Scientific	BP431-500
Thermal Scientific Embedding Medium	Fisher Scientific