Summary
Brain-Banking und systematische Entnahme von biologischem Material bildet die Grundlage für unvoreingenommene Stereologie und maximiert das Potenzial von Daten aus jeder Probe erhalten.
Abstract
Unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der insgesamt Neuron-Nummer (oder anderen Zelltyp) in einem bestimmten Bereich von Interesse
Protocol
Teil 1: Pre-Processing von Gewebe
- Tissue sollte gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten.
- Das Gehirn soll stereotaxically blockiert, entfernt aus dem Schädel, gewogen und Volumen bestimmt 2. Das Gewebe sollte dann in abgestufter Saccharose-Lösungen mit einer Endkonzentration von 30% Saccharose in Phosphatpuffer cryoprotected werden. Blockiert von Gewebe sollte dann in Isopentan bei -65 ° C eingefroren und bei -80 ° C bis Sie bereit sind zu schneiden sind.
Teil 2: Systematische Sampling
- Systematische Stichproben beruht auf einem richtigen Plan vor dem Schneiden. Die gesamte Region von Interesse sowohl in der rostral-caudalen und dorsalen-ventralen Ausmaß sollte genau definiert werden. Eine stereotaktische Atlas der Arten in Gebrauch ist hilfreich, um die Region von Interesse zu definieren und die Länge der Region von Interesse zu bestimmen. Sobald die Länge der Region von Interesse bestimmt ist es notwendig, das Abtastintervall zu etablieren. Zum Beispiel aus der stereotaktischen Atlas Sie feststellen, dass die gesamte rostro-kaudale Ausdehnung der Region von Interesse von ca. 3 mm in der Länge ist, wenn Schnitte in der Frontalebene. Sie entscheiden dann, mit dem Kryostaten Abschnitt gesetzt bei 50 um, in diesem Tempo werden Sie 60 Abschnitte für den rostral-kaudale Ausdehnung der Region von Interesse sind. Für eine typische unvoreingenommene stereologische Studie 6-10 systematisch abgetastet Abschnitte sind erforderlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. In diesem Beispiel 10 Sektionen gleichmäßig über die rostro-kaudale Ausdehnung Ergebnis in einem Abtastintervall von 1 / 6 Abschnitte verteilt.
Teil 3: Erstellung des Gehirns Bank
- Sobald der Abschnitt Abtastfrequenz bestimmt worden ist, ist der nächste Schritt, um zu bestimmen, die Flecken sofort durchgeführt werden. Zum Beispiel, wenn Sie mit Kresylviolett Färbung die Sie aufnehmen 1 / 6 Abschnitte auf einer Folie. Dies wird series 1 sein. Wenn Sie wissen, dass es vielleicht mehrere potenzielle Antikörper, die Sie gerne laufen, aber entweder wollen die Daten sehen, dass Ihre primäre Fleck stellt oder haben einfach nicht die Zeit, die Immunhistochemie durchzuführen, legen Sie die restlichen 5 Reihe von Abschnitten in der Reihenfolge ihres wurden in Vertiefungen mit Antigen zu erhalten (1% Polyvinylpyrrolidon, 50% Ethylenglykol in o.1M PBS, pH 7,4) in Scheiben geschnitten. Die folgende Tabelle bietet einen Stichprobenplan, bestehend aus 1 Rutsche und 1 Platte (Standard 48-Well-Platte) der Abschnitte als Teil eines Gehirns Bank (Tabelle 1).
Tabelle 1. Der Abschnitt Abtastfrequenz hier ist 1 / 6. Der erste Abschnitt ist auf einer Folie für Kresylviolett Färbung gelegt und die nächsten 5 Sektionen werden in Antigen platziert zu bewahren. Nummer des Abschnitts 7 wird dann auf der Folie erfasst und Abschnitte 9-12 sind in Antigen platziert zu bewahren. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis die Region von Interesse oder die Sperrung von Gewebe ist erschöpfend geschnitten. - Der nächste Schritt ist, um abschließend Abschnitt des Blocks von Gewebe. Legen Sie eine kleine Menge Einbettmedium auf dem Futter und lassen Sie es einfrieren. Legen Sie das Futter in den Mikrotom Kopf und abrasieren genug von den gefrorenen Mediums auf eine ebene Oberfläche haben. Entfernen Sie das Futter aus dem Mikrotom Kopf und Stelle flach innerhalb des Kryostaten. Gießen Einbettmedium auf dem Futter und einen festen Platz im Gehirn blockieren mit dem stereotaxically Schnittseite flach auf dem Futter positioniert. Langsam und vollständig eingebettet in das Gehirn Eindeckmedium. Legen Sie das Futter mit dem Gehirn in das Mikrotom Kopf und Abschnitt mit dem vorher festgelegten Parameter für den Abschnitt Sampling-Frequenz.
- Nachdem der Block des Gewebes wurde abschließend geschnitten und Abschnitte sind in Vertiefungen gegeben, decken Sie die Platte mit dem Deckel, wickeln Sie den Deckel mit Parafilm und in einem -20 ° C Gefrierschrank. Melden Sie sich die Gesamtzahl der Abschnitte für jede Serie, die section-Abtastintervall, und die Anzahl der Reihen für jedes Tier übernommen. Dieses Protokoll wird entscheidend sein, den Überblick über nachträgliche Entfernung von Teilen davon abhalten, das Gehirn Bank für zukünftige Immunhistochemie.
Teil 4: Repräsentative Ergebnisse:
Systematische Stichproben auf diese Weise eine gängige Praxis in unserem Labor in den letzten 3 Jahren. Wir hatten viel Erfolg Durchführung Immunhistochemie auf Material, das in Antigen gespeichert wurde erhalten drei Jahre nach, ohne eine Verschlechterung des Signals (Abbildung 1) in Scheiben geschnitten wurde. Darüber hinaus als Teil unseres Gehirns Bank haben wir rund 20.000 systematische Abschnitte des nicht-menschlichen angemeldetPrimatengehirn (Abbildung 2) als Teil unserer langfristigen Forschungs-Pläne. 
Abbildung 1. Dies ist ein Ausschnitt aus dem okzipitalen Pol des nicht-menschlichen Primaten ist immungefärbt für NeuN zeigt sowohl Schicht VI und interstitielle weißen Substanz Nervenzellen. Dies insbesondere Abschnitt wurde in Antigen gespeichert bewahren bei -20 ° C für einen Zeitraum von 2 Jahren. Maßstab = 100 um. 
Abbildung 2. Unsere vervet Gehirn Bank besteht heute aus rund 20.000 systematische Abschnitte aus über 30 Affen.
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Discussion
Systematische Stichproben ist eine kostengünstige Methode soll Forschungsmaterial zu maximieren. Diese Strategie der Probenahme ist so konzipiert, mit dem geltenden nationalen unvoreingenommene Stereologie, dass die systematische Stichproben in der gesamten Region erfordert entsprechen. Es ist wichtig, dass die Reihenfolge der Abschnitte für jede Serie beibehalten wird. In unserem Labor haben wir erfolgreich diese Methode für Banken sowohl Hamster und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten verwendet. Bisher haben wir knapp 20.000 grünen Meerkatze (Chlorocebus aethiops sabeus) Hirnschnitten gesammelt und routinemäßig immunohistochemisty auf Abschnitte, die über ein Jahr lang gelagert wurden. Die Vorteile eines gut charakterisierten Gehirn Bank umfassen die Möglichkeit, Daten zwischen Förderentscheidungen, die Fähigkeit für neue Studenten, schnell Daten zu sammeln, und Minimierung des Einsatzes und der Behandlung von neuen Tieren dadurch maximiert Forschungsmittel zu sammeln.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Ikiel Ptito für seine weitere fachliche Unterstützung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol | Fisher Scientific | E178-4 | |
| Polyvinyl pyrrolidone | Fisher Scientific | BP431-500 | |
| Thermal Scientific Embedding Medium | Fisher Scientific |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space. J Vis Exp. , (2009).
