Summary
פרימטים שאינם בני אדם היא מין translational חשוב להבנת התפתחות והזדקנות. הארגון האנטומי של הרשתית הפרימטים עשויה לספק תובנות חשובות בתנאים נורמליים ופתולוגיים אצל בני אדם.
Abstract
מערכת הראייה בבני אדם נחשב השער העולם, משחקת תפקיד עיקרי שפע של תהליכים חושית תפיסתית וקוגניטיבית. לכן זה לא מפתיע כי איכות הראייה קשורה איכות החיים. למרות מחקר קליני ובסיסי נרחב המקיף את הסיבות של הפרעות ראייה, צורות רבות של ליקויי ראייה, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה ניוון מקולרי, העדר טיפולים יעילים. Non-אנושי הפרימטים יש תכונות כלליות הקרוב של התפתחות העין לזו של בני האדם. לא רק שיש להם אנטומיה של כלי הדם דומה, אבל בקרב יונקים אחרים, יונקים יש מאפיין ייחודי של בעל האזור ברשתית הזמני מיוחדים עבור חדות הראייה גבוהה, את הגומה
Protocol
חלק 1: טרום עיבוד של רקמות
- רקמות צריך להיות perfused היטב עם paraformaldehyde, glutaraldehyde, או פורמלין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות זלוף transcardial הסטנדרטית המשמשת בדרך כלל כדי לקצור איברים אחרים. מומלץ כי זמן קצר לאחר להקריב את העיניים להיות מוזרק עם מקבע רק תחת עדשת ומאוחסנים מקבע.
- במחקר הנוכחי הנושא היה מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ"ג / ק"ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ"ג / ק"ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין. זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר).
חלק 2: הסרת גלגל העין מחלל מסלולית
- עבור גישה קלה יותר גלגל העין מומלץ להסיר תחילה את המוח. לאחר במוח הוסרה עצם דק דופן במסלול היא ברורה ממבט ראשון. השתמש rongeurs העצם לאט לפורר את החומה של מסלול. לחתוך את שרירי העין עם אזמל ולהסיר את רקמת החיבור של גלגל העין. לחתוך בזהירות את עצב הראייה, זה יכול לשמש במחקרים מיקרוסקופיה אלקטרונית. גלגל העין אמור כעת להשתחרר חלל מסלולית.
חלק 3: מנתחים את הרשתית מן עיינית
- מניחים את העין לתוך צלחת פטרי עם PBS לשמור על הרשתית מפני התייבשות. מיקרוסקופ לנתח או שולחן רכוב מגדלת לעמוד באור שימושי לנתיחה, אך לא הכרח. הסר את הקרנית על ידי חיתוך sclera הדוק למתחם של הקרנית ברמה של serrata אורה עם זוג מספריים באביב ולהסיר את העדשה עם מלקחיים.
- שימוש במכחול, מלקחיים, ומספריים באביב כדי להסיר את הרשתית מן בלובן העין. הדבר נעשה על ידי הפרדת הרשתית מן בלובן העין ולאחר מכן חיתוך sclera משם עם המספריים. צריך לבצע את התהליך הזה במרווחים קטנים כדי לא לגרום נזק או לקרוע את רקמת הרשתית. בלובן העין אינו מופרד בקלות מן העצב שריד אופטיים כך בזהירות לחתוך את sclera סביב עצב הראייה.
- בנקודה זו הרשתית שמרה צורה מעוגלת שלה צריך להיות שטוח לדגימה. לפני משטחת את הרשתית, שבזגוגיות, אשר יש לו את העקביות של ג'לי, ניתן להסיר גוש. כדי לשטח את הרשתית על גבי שקופית, לבצע חתכים רדיאליים עם להב מספר אזמל. שבזגוגיות שיורית כעת ניתן להסיר עם נייר סינון רגיל במכחול. השכבה הרשתית תא גנגליון נחשף בשלב זה, כך קיים הכרח להיות עדין כאשר הסרת הומור זגוגי. אם עצב הראייה מחוברת עדיין דיסק אופטי, להסיר את עצב הראייה בלי לקרוע את הרשתית באמצעות להב אזמל מספריים האביב. זהו עכשיו הרשתית הר שטוח (איור 1) ואת הגומה צריך להיות ברור ככתם כהה לכיוון הזמני / הגחון מדיסק אופטי.
חלק 4: דגימה
- ישנן מספר אפשרויות עבור הדגימה את הרשתית. כאן נתאר את ההכנות flatmount ודגימה isodentric. עבור פרוצדורות הן flatmount הרשתית עם שכבת סיבים אופטיים מן השקופית. אם הכוונה היא לבחון את תא הגנגליון ברשתית השכבה בהכנת flatmount, יש צורך להסיר או להלבין את פיגמנט אפיתל. כדי להסיר את האפיתל פיגמנט להשתמש במכחול קל להסיר חלק של שכבה זו, זה נוטה לגרום נזק לשכבת photoreceptor. הלבנה כולל השריית הרשתית בפתרון permanganate אשלגן (0.25%) במשך שעה 1, שטיפה במים מזוקקים, וסליקה, חומצה אוקסלית (5%) במשך 5 דקות. 2
- אם הכוונה היא לבחון את חלוקת התא המורפולוגיה של כל שכבה בכל הרשתית, ולאחר מכן אנו מציעים דגימה איזומטרי של הרשתית. הרשתית יש flatmounted בשקופית והמשיך לח עם PBS. עבור דגימה איזומטרי לחתוך חתיכות קטנות של רקמה במרחק שווה מדיסק אופטי ב, כיוונים האף הזמני, העליון והתחתון (איור 1). אין זה הכרחי כדי להלבין את האפיתל פיגמנט בהכנה זו. חלקים אלה יכולים עכשיו להיות מחולק במישור העטרה עם cryostat, vibratome, או ultramicrotome בהתאם שאלת המחקר. עבור חתך cryostat, החלקים צריכים להיות cryoprotected ב סוכרוז 30% בין לילה קפוא בהקשר של מדיום גובר על קרח יבש. לחלופין, הדגימות יכול להיות מוטבע אגר ופרוסים על vibratome. Cryostat וההכנות vibratome יהיה אמין תשואה סעיפים רזה כמו 4 מטר אם הסעיפים רזה נדרשים (למשל להכנת מיקרוסקופ אלקטרונים), יש צורך להכין את דגימות ultramicrotome. כדי לעשות זאת, הסעיפים צריך להיות פוסט קבוע tetroxide אוסמיום שעה 1 תחת fumehood. זה ואחריו התייבשות בסדרה אתנול מדורגים (50, 70, 95, 95, 100, 100%) ותחמוצת פרופילן 100%. הרקמהמוטבע אז EPON (שבץ-812 ערכת הטבעה).
חלק 5: תוצאות נציג:
במעבדה שלנו, אנו מבצעים באופן שגרתי אימונוהיסטוכימיה על רשתיות cryosectioned (איור 2). במקרה זה אנו מעוניינים isodensity של קולטנים קנבינואידים (CB1) ברשתית הפרימטים. יש לנו גם לבחון את ההשפעות של החשיפה אתנול טרום לידתי על מערכת הראייה הפרימטים. לשם כך, אנו מעוניינים צפיפות התאים ואת עובי השכבה ואת הגומה ברשתית ההיקפית. כדי להשיג זאת, עלינו להטביע פיסות של הרשתית ב EPON, פרוסה ב 700nm על ultramicrotome, ואת הכתם עם 1% toluidine כחול (איור 3).
איור 1 רשתית Flatmount. חתכים מחוגי משמשים לשטח את הרשתית.
איור 2 Immunostaining. Cryosection של הרשתית ההיקפית immunostained עבור CB1 שבו תאים הגנגליון ברשתית מסומנים בכבדות עם תיוג כמה בשכבות הגרעין הפנימי לחיצוני. העובי של סעיף זה הוא 14 מ 'ומוכתמת בשקופית. RG - שכבת הגנגליון ברשתית; IP - השכבה הפנימית plexiform; ב - שכבת הגרעין הפנימית; OP - השכבה החיצונית plexiform; על - השכבה החיצונית גרעיני.
איור 3 הגומה. סעיף דרך הגומה שהיה מוטבע EPON ופרוסים על ultramicrotrome ב 700nm. השכבה photoreceptor (PR) שימש כדי ליישר את הסעיפים. שימו לב עד כמה כל photoreceptors ניתן לזהות המציין זווית המתאים המטוס העטרה. מדידות צפיפות צולמו 300 מ ', 500 מ', ו - 800 מ 'ממרכז הבור foveal באמצעות מערכת דימות Bioquant.
RG - שכבת הגנגליון ברשתית; IP - השכבה הפנימית plexiform; ב - שכבת הגרעין הפנימית; OP - השכבה החיצונית plexiform; על - השכבה החיצונית גרעיני; בר בקנה מידה = 50 מ '
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההכנה של הרשתית כמו wholemount מאפשר ניתוח של הטופוגרפיה ואת הפריסה המרחבית של השכבה או תא גנגליון או לתאי אנדותל של כלי הדם ברשתית 3. כימות צפיפות התאים בפריפריה של הרשתית הפרימטים מושגת בקלות. עם זאת, באזורים perifoveal ו foveal, הערימה של שכבות מרובות בשכבה תא גנגליון מונעת כימות. כדי לעקוף זאת הטיה פוטנציאלית, הגומה ובאזור perifoveal יכול להיות גזור מתוך הכנת wholemount, מוטבע EPON ו מחולק סדרתי באמצעות ultramicrotome לקבל חצי דקה סעיפים במישור העטרה 2,4. ישנם מספר חסרונות אחרים בהכנת wholemount, אשר ניתן להתגבר עם פרדיגמות דגימה חלופית.
לקיחת דגימות מן איזומטרי הרשתית חתך במישור העטרה או על cryostat או vibratome מאפשר בחינה ספציפית של שכבות שונות, אשר לא ניתן לבצע בקלות על הכנה wholemount. חתך באופן זה גם מאפשר יישום של פרוטוקולי immnohistochemistry מספר 5. סעיפים אלה לאחר מכן ניתן להסיר את המגלשה, מוטבע EPON ופרוסים על ultramicrotome. עם שינויים קלים ultramicrotome בזווית חיתוך יכול להתבצע על מנת להבטיח מטוס העטרה רגיל דרך קולטני האור. ברגע מטוס סטנדרטי התקבל, עובי השכבה ניתן למדוד ולהשוות בין אזורים ונושאים הרשתית. יתר על כן, רקמות EPON מוטבע ניתן להשתמש במחקרים במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לחשוף את המאפיינים ultrastructural של הרשתית 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות Ikiel Ptito עבור התמיכה הטכנית שלו. אנו מודים פרנק ארווין, רוברטה Palmour ואנשי מדעי ההתנהגות קרן מעבדות ממוקם בסנט קיטס, הודו המערבית, על המשך התמיכה עבודתם הפרימטים שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
