Summary
비 인간 영장류가 개발 및 노화에 대한 우리의 이해를위한 중요한 translational 수종이다. 영장류 망막의 해부 학적 조직은 인간의 정상 및 병리 학적 조건에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Abstract
인간의 시각 시스템은 세계의 관문으로 간주하고 감각, 지각 및인지 과정의 과다에 주요 역할을합니다. 그것은 비전의 품질은 삶의 질을 묶어 것을 따라서 놀라운 일이 아닙니다. 시각 장애의 원인을 둘러싼 광범위한 임상 및 기초 연구에도 불구하고, 그러한 retinitis pigmentosa과 황반 변성 등 시각 장애, 여러 형태의 효과적인 치료를 부족합니다. 비 인간 영장류는 인간의 것과 눈 개발의 가장 일반적인 기능을 가지고 있습니다. 뿐만 아니라 그들은 유사한 혈관 해부학을 가지고 있지만, 다른 포유 동물 사이, 영장류가 높은 영상 시력, fovea에 대한 전문 시간적 망막에서 영역을 갖는 독특한 특성을 가지고 할
Protocol
1 부 : 조직의 사전 처리
- 조직은 잘 paraformaldehyde, 글루 타 알데히드, 또는 포르말린과 perfused해야합니다. 이것은 일반적으로 다른 장기를 수확하는 데 사용되는 표준 transcardial 재관류를 통해 달성될 수있다. 그것은 얼마 후이 눈이 그냥 렌즈에 따라 정착액과 주입과 정착액에 저장 희생하는 것이 좋습니다.
- 현재 연구에서 주제가 깊이 나트륨 pentobarbital (25 MG / kg, IV)의 과다로 euthanized 케타민을 하이드로 클로라이드 (10 MG / kg, IM)과 진정했고 완전히 exsanguinated 때까지 0.1 M PBS로 transcardially perfused. 이것은 5 분 (~ 1리터)을 PBS에 4 % paraformaldehyde 솔루션옵니다.
2 부 : 궤도 구멍에서 안구 제거
- 눈알을 쉽게하기 위해 그것은 먼저 두뇌를 제거하는 것이 좋습니다. 두뇌가 삭제되면 얇은 벽으로 둘러싸인 궤도 뼈가 쉽게 분명합니다. 서서히 궤도의 장벽을 멀리 칩에 뼈 rongeurs을 사용합니다. 메스로 안구 근육을 버려야하고 안구의 결합 조직을 제거합니다. 조심스럽게 시신경을 잘라, 이것은 전자 현미경 연구에서 사용할 수 있습니다. 눈알이 이제 궤도 캐비티에서 공개 되어야만합니다.
파트 3 : 세안 컵에서 망막을 해부하다
- 건조에서 망막을 유지하기 위해 PBS와 페트리 접시에 눈을를 놓습니다. 해부 현미경 또는 테이블 조명 스탠드를 확대하는 것은 필요하지 해부에 유용하지만, 장착. 스프링 가위로 오라 세라타의 수준에있는 각막의 경계와 밀접하게 공막엔을 절삭하여 각막을 제거하고 포셉와 렌즈를 제거합니다.
- 공막엔에서 망막을 제거하는 페인트, 포셉, 그리고 봄 가위를 사용합니다. 이것은 공막엔에서 망막을 분리 후 가위로 멀리 공막엔를 절단하여 이루어집니다. 하나는 작은 단위로있는만큼 손상이나 망막 조직을 찢어하지이 과정을 수행합니다. 공막엔는 쉽게 있도록 신중하게 시신경 주위 공막엔를 잘라 나머지 시신경에서 분리되지 않습니다.
- 이 시점에서 망막의 곡선 모양을 유지하고 샘플링을 위해 평평해야합니다. 망막을 평평화 전에 젤리의 일관성을 가진 유리 유머는, 덩어리에서 제거할 수 있습니다. 슬라이드에 망막을 버리고, 메스 블레이드 여러 레이디얼 인하합니다. 잔여 유리체의 유머는 이제 일반 필터 종이와 페인트로 제거할 수 있습니다. 그것은 유리 유머를 제거하면 부드럽게하는 필수적인하므로 망막 신경절 세포 레이어는이 시점에서 노출됩니다. 시신경이 여전히 광학 디스크에 연결된 경우, 메스 칼날과 봄 가위를 사용하여 망막을 추출하지 않고 시신경을 제거합니다. 이것은 이제 평면 마운트 망막 (그림 1)이고 fovea는 광학 디스크에서 시간적 / 복부 방향으로 어두운 패치로 명확해야합니다.
4 부 : 샘플링
- 망막을 샘플링 옵션이 많습니다. 여기서 우리는 flatmount 준비와 isodentric 샘플링을 설명합니다. 모두를위한 절차는 멀리 슬라이드에서 광섬유 레이어로 망막을 flatmount. 의도가 flatmount 준비에서 망막 신경절 세포 레이어를 조사하는 경우도 색소 상피를 제거하거나 표백하는 것이 필요합니다. 색소 상피이 레이어의 일부를 제거하는 가볍게 페인트를 사용하여 제거하려면,이 photoreceptor 레이어를 손상하는 경향이있다. 표백하면, 1 시간 동안 칼륨 과망간산염 솔루션 (0.25 %)에서 망막에 몸을 담글 수 증류수로 세척하고, 5 분 괭이밥에서 채취한 산성 (5 %)에서 지우면 포함됩니다. 2
- 의사가 망막을 통해 각 계층의 세포 분포 및 형태를 조사할 수있다면, 우리는 망막의 사시도 샘플링을 제안한다. 망막은 슬라이드에 flatmounted하고 PBS로 젖은 보관해야합니다. 사시 샘플링에 대한 콧소리, 현세의 상위 및 하위 경로 (그림 1)에있는 광학 디스크에서 등거리 조직의 작은 조각을 잘라 버릴거야. 이런 준비에 표백제 색소 상피를 필요는 없습니다. 이 작품은 현재 연구 질문에 따라 그라 이오 스탯, vibratome 또는 ultramicrotome와 코로나 비행기에서 sectioned 수 있습니다. 그라 이오 스탯의 sectioning 들어, 조각은 야간 30 % 자당에 cryoprotected이어야하며 드라이 아이스에 장착 매체의 맥락에서 냉동. 또한, 샘플은 한천에 포함된하고 vibratome에 얇게하실 수 있습니다. 그라 이오 스탯 및 vibratome 준비가 안정적으로 4 미터만큼 얇은 부분을 얻을 것입니다 얇은 섹션 (전자 현미경의 준비 등) 필요한 경우, 그것은 ultramicrotome에 대한 샘플을 준비하는 것이 필요합니다. 이렇게하려면 섹션 fumehood에 따라 1 시간 오스뮴 tetroxide에 포스트 수정되어야합니다. 이 등급 에탄올 탈수 시리즈 (50, 70, 95, 95, 100, 100 %) 및 100 %의 프로필렌 산화물옵니다. 조직다음 Epon (임베드 - 812 포함 키트)에 포함된 것입니다.
제 5 부 : 대표 결과 :
저희 연구실에서는, 우리는 정기적으로 cryosectioned retinae (그림 2)에 immunohistochemistry을 수행합니다. 이 경우에는 우리는 영장류 망막에서 cannabinoid 수용체 (CB1)의 isodensity에 관심이 있습니다. 우리는 또한 영장류 시각 시스템에 태아 에탄올 노출의 효과를 검사합니다. 이를 위해, 우리는 fovea과 주변 망막에있는 세포 밀도와 레이어의 두께에 관심이 있습니다. 이것을 달성하기 위해, 우리는 ultramicrotome에 700nm에서, Epon에 슬라이스를 망막의 조각을 포함,, 1 % toluidine 블루 (그림 3)와 얼룩.
그림 1 Flatmount의 망막. 레이디얼 상처는 망막을 평평하게하는 데 사용됩니다.
그림 2 Immunostaining가. 주변 망막의 Cryosection는 망막 신경절 세포가 많이 안쪽과 바깥 핵 층의 일부 레이블과 레이블 아르 CB1에 대한 immunostained. 이 섹션의 두께는 슬라이드에서 14m와 얼룩이다. RG - 망막 신경절 층, IP - 내부 plexiform 층, IN - 내부 핵 계층, OP - 외부 plexiform 층, ON - 바깥 핵 층.
Epon에 포함된하여 700nm에서 ultramicrotrome에 얇게 있던 fovea을 통해 그림 3 Fovea. 절을 참조하십시오. photoreceptor 층 (PR)이 섹션을 정렬하는 데 사용되었다. photoreceptors의 전체 범위가 코로나 비행기에 적절한 각도를 나타내는 확인할 수 있습니다납니다. 밀도 측정은 300m, 500m, 그리고 Bioquant 이미징 시스템을 사용 foveal 구덩이의 중심에서 800m에서 찍은.
RG - 망막 신경절 층, IP - 내부 plexiform 층, IN - 내부 핵 계층, OP - 외부 plexiform 층, ON - 바깥 핵 층, 규모 표시줄 = 50m
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Discussion
wholemount로 망막의 준비는 지형과 신경절 세포 레이어 또는 망막 혈관 3 내피 세포 중의 공간적 분포의 분석을 위해 수 있습니다. 영장류 망막의 주변에있는 세포 밀도 부량이 쉽게 수행됩니다. 그러나 perifoveal 및 foveal 지역에서 신경절 세포 레이어에 여러 레이어 스태킹은 부량을 방해. 이러한 잠재적인 편견을 회피하려면, fovea 및 perifoveal 지역은 코로나 비행기 2,4 년 반 얇은 섹션을 얻기 위해 ultramicrotome를 사용하여 wholemount 준비에서 해부 Epon에 포함된, 그리고 순차적으로 sectioned 수 있습니다. 대체 샘플링 패러다임과 함께 극복할 수있는 wholemount 준비, 다른 단점이 많습니다.
망막에서 사시 샘플을 채취하고 그라 이오 스탯이나 vibratome 중의 코로나 비행기에 sectioning 것은 쉽게 wholemount 준비에 수행할 수없는 다른 레이어의 특정 시험을 수 있습니다. 이러한 방식으로 Sectioning하면 여러 immnohistochemistry 프로토콜 5 응용 프로그램에 대한 수 있습니다. 이 섹션은 다음 슬라이드에서 제거 Epon에 포함된하고 ultramicrotome에 얇게하실 수 있습니다. 절단 각도 ultramicrotome 사소한 변경 photoreceptors을 통해 표준 코로나 비행기를 보장하기 위해 만들 수 있습니다. 표준 비행기가 획득되면, 층 두께 측정 및 망막 지역과 과목 사이에 비교할 수 있습니다. 또한, Epon 포함된 조직은 망막 6 ultrastructural 특성을 나타내기 위해 전자 현미경 연구에서 사용할 수 있습니다.
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Acknowledgments
저자는 자신의 기술 지원 Ikiel Ptito 감사하고 싶습니다. 우리는 프랭크 에르빈, 로버타 Palmour 및 영장류 작품들의 지속적인 지원 세인트 키츠에 위치한 Behavioural 과학 재단 연구소, 웨스트 인디스의 직원에게 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
