Summary
Не-человеческое приматов является важным поступательное видов для нашего понимания развития и старения. Анатомическая организация приматов сетчатки может предоставить важную информацию о нормальных и патологических состояний у человека.
Abstract
Зрительной системы у человека считается воротами в мир и играет основную роль в множество сенсорных, перцептивных и когнитивных процессов. Поэтому не удивительно, что качество зрения связана с качеством жизни. Несмотря на широкое клинических и фундаментальных исследований окружающей причин визуальные расстройства, многие формы нарушения зрения, такие, как пигментный ретинит и дегенерация желтого пятна, отсутствие эффективных методов лечения. Номера для человека приматов имеют самые тесные общие черты развития глаза, что и люди. Мало того, что они имеют аналогичный сосудистой анатомии, но и среди других млекопитающих, приматы имеют уникальные характеристики, имеющие региона в височной сетчатки специализируется на высокую остроту визуальных, ямки
Protocol
Часть 1: Предварительная обработка тканей
- Ткань должна быть хорошо озарен параформальдегида, глутаральдегида или формалина. Это может быть достигнуто с помощью стандартных transcardial перфузии обычно используется для сбора других органов. Рекомендуется, что вскоре после жертву глазами быть введен с фиксатором только под объектив и хранится в фиксаторе.
- В настоящем исследовании тема глубоко седативные с кетамин гидрохлорид (10 мг / кг, внутримышечно), эвтаназии с передозировкой натрия фенобарбитала (25 мг / кг, внутривенно) и перфузии transcardially 0,1 М PBS пока полностью обескровлены. Далее следуют 4% параформальдегида решение в PBS в течение 5 мин (~ 1 литр).
Часть 2: удаление глазного яблока из орбитальной полости
- Для облегчения доступа к глазному яблоку, рекомендуется сначала удалить мозга. Как только мозг был удален тонкостенных орбиту кости очевидны. Используйте кости rongeurs медленно постепенно избавляться от стенки глазницы. Срежьте глазных мышц с помощью скальпеля и удалить из соединительной ткани глазного яблока. Аккуратно вырежьте зрительного нерва, это может быть использовано в электронной микроскопии. Глазное яблоко должно быть освобождено от орбитальной полости.
Часть 3: Рассеките сетчатку от наглазник
- Место глаза в чашку Петри с PBS держать сетчатку от высыхания. Рассекает микроскоп или увеличительное стол монтируется свет стоять полезно в рассечение, но не является необходимостью. Удалить роговицы за счет сокращения склеры близко к периметру роговицы на уровне ора Серрата с парой весной ножницами и удалить объектив с щипцами.
- Используйте кисть, пинцет, ножницы и весной, чтобы удалить сетчатку от склеры. Это делается путем разделения сетчатку от склеры и резки склеры покончить с ножницами. Надо осуществлять этот процесс с небольшим шагом, чтобы не повредить или порвать ткани сетчатки. Склеры не легко отделить от остатков зрительного нерва так тщательно вырезать склеры вокруг зрительного нерва.
- На данный момент сетчатки сохранил свою изогнутую форму и должен быть плоский для отбора проб. Перед уплощение сетчатки, стекловидного тела, которая имеет консистенцию желе, могут быть удалены в комок. Чтобы сгладить сетчатки на слайд, сделать несколько радиальных разрезов с лезвие скальпеля. Остаточные юмора стекловидного теперь могут быть удалены с помощью обычного фильтровальную бумагу и кисти. Сетчатки слой ганглиозных клеток подвергается в этой точке, так что необходимо быть нежным, когда удаление стекловидного тела. Если зрительный нерв до сих пор приводится в оптический диск, удалите зрительного нерва без предыдущего извлечения сетчатке использованием лезвие скальпеля и пары весной ножницами. Теперь это плоская гора сетчатки (рис. 1) и ямки должно быть очевидно, как темное пятно в височной / вентральной направлении от диска зрительного нерва.
Часть 4: Отбор проб
- Есть несколько вариантов для отбора проб сетчатки. Здесь мы опишем flatmount подготовки и isodentric выборки. Для обеих процедур flatmount сетчатки с оптической слой волокна от слайда. Если намерение заключается в изучении клеточного слоя сетчатки ганглия в flatmount подготовки, необходимо удалить или отбеливателя пигментный эпителий. Чтобы удалить пигментный эпителий использовать кисть слегка, чтобы удалить часть этого слоя, это приводит к повреждению фоторецепторов слоя. Отбеливание включает замачивание сетчатки в раствор перманганата калия (0,25%) в течение 1 часа, стиральная в дистиллированной воде, а также очистка в щавелевой кислоты (5%) в течение 5 минут 2.
- Если намерение заключается в изучении распределения клеток и морфология каждого слоя всей сетчатке, то мы предлагаем изометрической выборки сетчатки. Сетчатке должно быть flatmounted на слайде влажной, с PBS. Для изометрической выборки нарезать небольшими кусками ткани на равном расстоянии от диска зрительного нерва в носовой, временных, верхней и нижней стороны (рис. 1). Это не обязательно, чтобы отбелить пигментный эпителий в этой подготовке. Эти произведения теперь могут быть секционного в корональной плоскости с криостата, vibratome или ультрамикротоме в зависимости от исследования вопроса. Для криостат секционирования, части должны быть cryoprotected в 30% сахарозы в ночное время и замороженных в контексте установки среды на сухой лед. Кроме того, образцы могут быть внедрены в агар и нарезанная на vibratome. Криостата и vibratome препаратов будет надежно выход разделы, как тонкий, как 4 м. Если тоньше разделы необходимы (например, для подготовки электронного микроскопа), необходимо подготовить образцы для ультрамикротоме. Чтобы сделать это, разделы должны быть после зафиксировано в осмия в течение 1 часа под fumehood. Это сопровождается обезвоживанием в серии градуированных этанола (50, 70, 95, 95, 100, 100%) и 100% пропилена. ТканиЗатем встроенный в Epon (EMBED-812 вложение комплект).
Часть 5: Представитель Результаты:
В нашей лаборатории мы ежедневно выполняют иммуногистохимии на cryosectioned сетчатки (рис. 2). В этом случае мы заинтересованы в isodensity каннабиноидных рецепторов (CB1) на приматах сетчатки. Мы также рассмотрим последствия пренатального воздействия этанола на приматов зрительной системы. С этой целью, мы заинтересованы в ячейке плотности и толщины слоя в центральной ямке и в периферической сетчатке. Чтобы достичь этого, мы вкладываем части сетчатки в Epon, нарежьте на 700 нм на ультрамикротоме, и пятна с 1% толуидиновым синим (рис. 3).
Рисунок 1 Flatmount сетчатки. Радиальные сокращения используются для выравнивания сетчатки.
Рисунок 2 Иммуноокрашивание. Cryosection периферической сетчатки immunostained для CB1 где ганглиозных клеток сетчатки в значительной степени помечены некоторые маркировке на внутренней и внешней ядерной слоев. Толщина этого раздела составляет 14 м и витражи на слайде. RG - слой сетчатки ганглия; IP - внутренний слой плексиформные; В - внутренний ядерный слой; OP - внешний слой плексиформные; ON - наружный ядерный слой.
Рисунок 3 Fovea. Раздел через ямки, что было заложено в Epon и нарезанный на ultramicrotrome на 700 нм. Фоторецепторов слой (PR) было использовано для выравнивания разделов. Обратите внимание, что на всем протяжении фоторецепторов может быть идентифицирован указывает соответствующий угол в поперечной плоскости. Плотность измерения были проведены на 300 м, 500 м и 800 м от центра фовеа яму использованием Bioquant системы обработки изображений.
RG - слой сетчатки ганглия; IP - внутренний слой плексиформные; В - внутренний ядерный слой; OP - внешний слой плексиформные; ON - наружный ядерный слой; шкалы = 50 м
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подготовка сетчатки как wholemount позволяет анализ топографии и пространственного распределения либо слой ганглиозных клеток или эндотелиальных клеток кровеносных сосудов сетчатки 3. Количественная оценка плотности клеток на периферии сетчатки приматов легко осуществить. Однако, в perifoveal и фовеальной регионов, укладки нескольких слоев в слое ганглиозных клеток препятствует количественной оценке. Чтобы обойти эту потенциальную предвзятость, ямки и perifoveal регионе можно разрезать от wholemount подготовки, встроенные в EPON, и серийно секционного использованием ультрамикротоме получить полу-шлифов в корональной плоскости 2,4. Есть ряд других недостатков wholemount подготовки, которые могут быть преодолены с альтернативными парадигмами выборки.
Принимая изометрической образцы из сетчатки и секционирования в корональной плоскости с обеих криостате или vibratome позволяет конкретное изучение разных слоях, которые не могут быть легко выполнены на wholemount подготовки. Секционирование таким образом, также позволяет применение различных протоколов immnohistochemistry 5. Эти участки могут быть удалены из слайда, встроенные в Epon и нарезанный на ультрамикротоме. С ультрамикротоме незначительные изменения в угол резания может быть сделано, чтобы обеспечить стандартный корональной плоскости, проходящей через фоторецепторов. Как только стандартный самолет был получен, толщина слоя может быть измерена и сравнивались между сетчатки регионов и субъектов. Кроме того, встроенный Epon ткани могут быть использованы в исследованиям методами электронной микроскопии выявить ультраструктурные характеристики сетчатки 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Ikiel Ptito за его техническую поддержку. Мы благодарны Франк Эрвин, Роберта Palmour и сотрудники Фонда поведенческих наук лаборатории расположены в Сент-Китс, Вест-Индии, за их постоянную поддержку нашей работы приматов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
