Summary
ヒト以外の霊長類は、開発と老化の理解のための重要な並進種です。霊長類の網膜の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することがあります。
Abstract
ヒトの視覚系は、世界への入り口と考えられ、感覚、知覚や認知過程の過多で主要な役割を果たしている。それは視力の質、生活の質に結びついていることは驚くことではありません。視覚障害の原因を取り巻く広範な臨床および基礎研究にもかかわらず、このような網膜色素変性症や黄斑変性症などの視覚障害、、多くの形態では、効果的な治療法を欠いている。ヒト以外の霊長類はヒトと眼の発生の最も近い一般的な機能を備えています。だけでなく、彼らは同様の血管解剖を持っていますが、他の哺乳動物の中で、霊長類は、高視力に特化した耳側網膜に領域を有する固有の特性、中心窩を持っているか
Protocol
パート1：組織の前処理
- 組織はよくパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。これは通常、他の臓器を収穫するために使用される標準transcardial灌流によって達成することができます。それは直後には、ちょうどレンズの下に固定液を注入し、固定液に保存されていることが目を犠牲にすることをお勧めします。
- 本研究では被験者は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静したペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流。これは、5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液が続いている。
パート2：眼窩から眼球の除去
- 眼球へのアクセスを容易にするためには、まず脳を除去することをお勧めします。脳が削除されると薄肉の軌道の骨が容易に明らかである。徐々に軌道の壁を崩すために骨Rongeursを使用してください。メスで眼の筋肉を切り取ると、眼球からの結合組織を取り除く。慎重に視神経を切断、これは電子顕微鏡の研究に使用することができます。眼球は今眼窩から解放する必要があります。
パート3：アイカップから網膜を解剖
- 乾燥から網膜を保つためにPBSでシャーレに目を置きます。解剖顕微鏡または表では、ライトスタンドを拡大することが必要ではない解剖に有用ですが、マウント。春のはさみと鋸状縁のレベルで角膜の周囲に密接に強膜を切断することにより角膜を取り出して、ピンセットでレンズを取り外します。
- 強膜から網膜を削除するにはペイントブラシ、ピンセット、そして春のはさみを使用してください。これは、強膜から網膜を分離して、はさみで離れて強膜を切断することによって行われます。一つは、網膜組織を損傷したり涙にしないように少しずつでこのプロセスを実行する必要があります。強膜は容易にそう慎重に視神経の周り強膜を切断残骸視神経から分離されていません。
- この時点で網膜は、その湾曲した形状を保持し、サンプリングのために展開する必要がありますしています。網膜を平坦化する前に、ゼリーの一貫性を持っている硝子は、一括して削除することができます。スライドに網膜を平坦にする、手術用メスの刃を持つ複数の放射状のカットを行います。残留硝子のユーモアは、今普通のフィルター紙と絵筆を用いて除去することができます。それは硝子体液を除去するときに穏やかであることが不可欠であるので、網膜神経節細胞層は、この時点で公開されます。視神経がまだ視神経乳頭に接続されている場合は、手術用メスの刃と春のはさみを使って網膜をリッピングすることなく視神経を削除します。これは、現在のフラットマウントの網膜（図1）であり、中心窩は視神経乳頭からの時間/腹側方向に暗いパッチとして明らかなはずである。
第4部：サンプリング
- 網膜をサンプリングするためのオプションがいくつかあります。ここでは、flatmount準備とisodentricサンプリングを説明します。両方の手順については離れてスライドから視神経繊維層と網膜をflatmount。意図はflatmount準備の網膜神経節細胞層を調べることであれば、それはどちら色素上皮を除去または漂白する必要があります。色素上皮は、この層の一部を削除するために軽くブラシを使用して削除するには、これは、感光体層を破壊する傾向があります。漂白は、1時間過マンガン酸カリウム溶液の網膜（0.25％）を浸漬し、蒸留水で洗浄し、5分間シュウ酸（5％）でクリア伴います。2
- 意図が網膜全体に各レイヤのセルの分布と形態を検討するならば、我々は、網膜の等角サンプリングを示唆している。網膜は、スライド上flatmountedとPBSで湿った保つ必要があります。アイソメトリックサンプリングの場合は、鼻の頭、上下方向（図1）における視神経乳頭から等距離組織の小片をカット。それはこの準備の漂白剤色素上皮をする必要はありません。これらの作品は現在、クライオスタット、ビブラトーム、または研究の質問に応じて、ウルトラミクロトームによる冠状面で区分けすることができます。クリオスタット切片の場合、作品は一晩30％ショ糖で凍結保護されるべきであり、ドライアイス上で封入剤のコンテキストで凍結。また、サンプルは寒天に埋め込まれ、ビブラトームでスライスできます。クライオスタットとビブラトーム準備が確実に4メートルほどの薄いセクションが得られます薄いセクション（電子顕微鏡の準備用など）が必要な場合は、それは、ウルトラミクロトーム用試料を調製する必要がある。これを行うには、セクションでは、fumehoodの下で1時間オスミウム四酸化で後固定してください。これは、段階的エタノール系列で脱水（50、70、95、95、100、100％）と100％のプロピレンオキサイドが続いている。組織その後、エポン（EMBED - 812埋め込みキット）に組み込まれています。
パート5：代表的な結果：
当研究室では、我々は日常的にcryosectioned網膜（図2）で免疫組織化学を行う。この場合、我々は、霊長類の網膜におけるカンナビノイド受容体（CB1）の等密度に興味を持っています。我々はまた、霊長類の視覚システム上の出生前のエタノール曝露の影響を調べる。この目的のために、我々は、中心窩でと周辺網膜における細胞密度と層の厚さに興味を持っています。これを達成するために、我々は、ウルトラミクロトームで700nmの時、エポンでスライスを網膜の断片を埋め込む、と1％トルイジンブルー（図3）で染色。
図1 Flatmount網膜。ラジアルカットは網膜を平坦にするために使用されます。
図2免疫染色。末梢網膜の凍結切片は、網膜神経節細胞が大きく内側と外側核の層のいくつかのラベルで標識されているCB1を免疫染色。このセクションの厚さはスライド上の14メートルとステンドグラスです。 RG - 網膜神経層と、IP - 内網状層、IN - 内顆粒層、OP - 外網状層、ON - 外核層。
エポンに埋め込 まれ、700nmのでultramicrotromeにスライスされた窩を通じて、 図3中心窩。セクション。光受容体層（PR）は、セクションを位置合わせするために使用された。光受容体の全範囲が冠状面で適切な角度を示す識別できることに注意してください。密度の測定は300メートル、500メートル、そしてBioquantイメージングシステムを用いた中心窩ピットの中心から800mで採取した。
RG - 網膜神経層と、IP - 内網状層、IN - 内顆粒層、OP - 外網状層、ON - 外顆粒層、スケールバー= 50メートル
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Discussion
wholemountとして網膜の調製は、神経節細胞層や網膜血管3の内皮細胞のいずれかの地形と空間分布の解析が可能になります。霊長類の網膜の周辺部における細胞密度の定量化は容易に達成される。しかし、perifovealと中心窩の地域では、神経節細胞層で複数の層のスタッキングでは、定量化を妨げ。この潜在的なバイアスを回避するために、中心窩とperifoveal領域は、冠状面2,4に半薄切片を得るためにウルトラミクロトームを用いて、wholemount準備から解剖エポンに包埋、およびシリアル区分することができます。代替サンプリングパラダイムを克服することができますwholemount準備、他の多くの欠点があります。
網膜からアイソメトリックサンプルを採取し、クライオスタットまたはビブラトームのいずれかで冠状面での切片は、容易にwholemount準備を行うことができないさまざまな層の特定の検査が可能になります。この方法で切片も複数immnohistochemistryプロトコル5のアプリケーションが可能になります。これらのセクションは、次に、スライドから削除エポンに包埋し、ウルトラミクロトームでスライスできます。切削角のウルトラマイナーな変更では、光受容体を介して標準的な冠状面を確保するために行うことができます。標準的な平面を取得した後、層の厚さを測定し、網膜の領域と被験者の間で比較することができます。さらに、エポン包埋組織は、網膜6の超微細構造上の特徴を明らかにするために電子顕微鏡の研究に使用することができます。
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Acknowledgments
著者は、彼の技術サポートのためにIkiel Ptitoに感謝します。私たちは、霊長類の仕事の継続的なサポートのために、フランクエルヴィン、ロバータパーマー、セントキッツ、西インド諸島に位置する行動科学財団研究所のスタッフに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
