Summary
O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a nossa compreensão do desenvolvimento e envelhecimento. A organização anatômica da retina de primatas pode fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos.
Abstract
O sistema visual em humanos é considerada a porta de entrada para o mundo e desempenha um papel principal na infinidade de sentidos, processos perceptivos e cognitivos. Portanto, não é surpreendente que a qualidade de visão está ligada à qualidade de vida. Apesar da pesquisa clínica e básica generalizada sobre as causas de distúrbios visuais, muitas formas de deficiência visual, tais como retinite pigmentosa e degeneração macular, a falta de tratamentos eficazes. Primatas não-humanos têm o mais próximo características gerais do desenvolvimento do olho ao dos humanos. Não só eles têm uma anatomia semelhante vascular, mas entre outros mamíferos, os primatas têm a característica única de ter uma região na retina temporal especializados para a acuidade visual de alta, a fóvea
Protocol
Parte 1: Pré-processamento de tecido
- Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. Recomenda-se que logo após o sacrifício dos olhos ser injetado com o fixador apenas sob a lente e armazenados em fixador.
- No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro).
Parte 2: A remoção do globo ocular da cavidade orbital
- Para facilitar o acesso ao globo ocular recomenda-se remover primeiro o cérebro. Uma vez que o cérebro foi removido o osso da órbita de paredes finas é facilmente perceptível. Usar o fórceps osso para roer lentamente a parede da órbita. Cortaram os músculos oculares com um bisturi e remover o tecido conectivo do globo ocular. Corte cuidadosamente o nervo óptico, este pode ser utilizado em estudos de microscopia eletrônica. O globo ocular deve agora ser lançado a partir da cavidade orbital.
Parte 3: Dissecar a retina ocular do
- Colocar o olho em uma placa de Petri com PBS para manter a retina de secagem. Um microscópio de dissecação ou mesa montada ampliação suportar a luz é útil para a dissecação, mas não uma necessidade. Remova a córnea, cortando a esclera de perto para o perímetro da córnea ao nível da ora serrata com um par de tesouras primavera e remover a lente com a pinça.
- Use um pincel, pinça, tesoura e mola para remover a retina da esclera. Isto é feito através da separação da retina da esclera e depois corte a esclera acabar com a tesoura. Deve-se realizar este processo em pequenos incrementos de modo a não danificar ou rasgar o tecido da retina. A esclera não é facilmente separado do nervo óptico remanescente tão cuidadosamente cortar a esclera em torno do nervo óptico.
- Neste ponto, a retina manteve sua forma curva e precisa ser aplainado para a amostragem. Antes de achatamento da retina, o humor vítreo, que tem a consistência de geléia, podem ser removidos em um caroço. Para achatar a retina em um slide, fazer vários cortes radiais com uma lâmina de bisturi. O humor vítreo residual pode agora ser removido com papel de filtro comum e um pincel. A camada de células ganglionares da retina é exposta neste momento por isso é imperativo para ser gentil ao remover o humor vítreo. Se o nervo óptico ainda está ligado ao disco óptico, remova o nervo óptico sem rasgar a retina usando uma lâmina de bisturi e uma tesoura de mola. Esta é agora uma retina montagem plana (Figura 1) e fóvea deve ser aparente como uma mancha escura na direção temporal / ventral do disco óptico.
Parte 4: Amostragem
- Há uma série de opções para a amostragem da retina. Aqui vamos descrever a preparação e amostragem flatmount isodentric. Para ambos os procedimentos flatmount da retina com a camada de fibra óptica de distância do slide. Se a intenção é examinar a camada de células ganglionares da retina na preparação flatmount, é necessário remover ou lixívia do epitélio pigmentado. Para remover o epitélio pigmentado use um pincel levemente para remover alguma desta camada, esta tende a danificar a camada de fotorreceptores. Clareamento envolve embeber a retina em solução de permanganato de potássio (0,25%) por 1 hora, lavar em água destilada, e limpando em ácido oxálico (5%) por 5 minutos. 2
- Se a intenção é examinar a distribuição de células e morfologia de cada camada em todo o retina, então sugerimos amostragem isométrica da retina. A retina deve ser flatmounted em um slide e mantido úmido com PBS. Para a amostragem isométrica cortar pequenos pedaços de tecido eqüidistantes do disco óptico no nasal, direções temporal, superior e inferior (Figura 1). Não é necessário para branquear a epitélio pigmentado nesta preparação. Essas peças podem agora ser seccionado no plano coronal com um criostato, vibratome, ou ultramicrótomo dependendo da questão de pesquisa. Para corte em criostato, as peças devem ser cryoprotected em sacarose 30% durante a noite e congelados no contexto de um meio de montagem em gelo seco. Alternativamente, as amostras podem ser incorporados em agar e cortados em um vibratome. O criostato e preparações vibratome confiantemente rendimento seções finas como 4 m. Se são necessários cortes mais finos (por exemplo, para a preparação de microscópio eletrônico), é necessário preparar as amostras para o ultramicrótomo. Para fazer isso, as seções devem ser pós-fixados em tetróxido de ósmio por 1 hora sob a fumehood. Isto é seguido por desidratação em uma série de etanol classificados (50, 70, 95, 95, 100, 100%) e óxido de propileno 100%. O tecidoé então incorporado em Epon (incorporar-812 kit incorporação).
Parte 5: Resultados Representante:
Em nosso laboratório, nós rotineiramente imunohistoquímica na retina cryosectioned (Figura 2). Neste caso, estamos interessados na isodensity dos receptores de canabinóides (CB1) na retina de primatas. Também examinamos os efeitos da exposição pré-natal de etanol no sistema de primatas visual. Para este fim, estamos interessados na densidade de células ea espessura da camada na fóvea e na retina periférica. Para conseguir isso, nós incorporar pedaços de retina em Epon, fatia a 700nm em um ultramicrótomo, e manchar com 1% de azul de toluidina (Figura 3).
Figura Retina Flatmount 1. Cortes Radial são usados para achatar a retina.
Figura imunocoloração 2. Cryosection da retina periférica histoquímica para CB1 onde as células ganglionares da retina são fortemente marcadas com alguma rotulagem nas camadas interiores e exteriores nuclear. A espessura desta seção é de 14 m e coradas no slide. RG - camada ganglionares da retina; IP - camada plexiforme interna; IN - camada nuclear interna; OP - camada plexiforme externa; ON - camada nuclear externa.
Figura 3 Fovea Seção. Através da fóvea que foi incorporado em Epon e cortados em um ultramicrotrome em 700nm. A camada de fotorreceptores (PR) foi usado para alinhar as seções. Observe que a extensão total dos fotorreceptores pode ser identificado, indicando um ângulo apropriado no plano coronal. Medidas de densidade foram realizadas em 300 m, 500 m e 800 m do centro do poço foveal usando o sistema de imagem BIOQUANT.
RG - camada ganglionares da retina; IP - camada plexiforme interna; IN - camada nuclear interna; OP - camada plexiforme externa; ON - camada nuclear externa; barra de escala = 50 m
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Discussion
A preparação da retina como um wholemount permite a análise da topografia e distribuição espacial de uma camada de células do gânglio ou as células endoteliais dos vasos sanguíneos da retina 3. Quantificação da densidade de células na periferia da retina de primatas é facilmente realizado. No entanto, em regiões perifoveal e foveal, o empilhamento de múltiplas camadas na camada de células ganglionares obstrui quantificação. Para contornar esse viés potencial, a fóvea e região perifoveal pode ser dissecada desde a preparação wholemount, embutido em Epon, e seccionados usando um ultramicrótomo para obter semi-finos no plano coronal 2,4. Há uma série de outras desvantagens para a preparação wholemount, que pode ser superado com paradigmas de amostragem alternativo.
Colheita de amostras isométrica da retina e secção no plano coronal em qualquer um criostato ou vibratome permite a análise específica das diferentes camadas, o que não pode ser facilmente realizado em uma preparação wholemount. Secção desta forma também permite a aplicação de protocolos immnohistochemistry múltiplas 5. Essas seções podem ser removidos do slide, incorporada em Epon e cortados em um ultramicrótomo. Com um ultramicrótomo mudanças menores no ângulo de corte pode ser feito para garantir um plano padrão coronal através do fotorreceptores. Uma vez que um plano padrão foi obtido, espessura da camada pode ser medido e comparado entre regiões da retina e assuntos. Além disso, Epon tecido incorporado pode ser utilizado em estudos de microscopia eletrônica para revelar características ultra-estruturais da retina 6.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu apoio técnico. Somos gratos a Frank Ervin, Palmour Roberta e ao pessoal da Fundação Ciências Comportamentais Laboratories localizado em São Cristóvão, West Indies, por seu apoio contínuo do nosso trabalho de primatas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
