Summary
Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la nostra comprensione dello sviluppo e dell'invecchiamento. L'organizzazione anatomica della retina dei primati potrebbe fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo.
Abstract
Il sistema visivo nell'uomo è considerata la porta verso il mondo e svolge un ruolo principale nella pletora di sensoriali, i processi percettivi e cognitivi. Non è quindi sorprendente che la qualità della visione è legata alla qualità della vita. Nonostante la diffusa ricerca clinica e di base che circonda le cause dei disturbi visivi, molte forme di disabilità visive, come la retinite pigmentosa e la degenerazione maculare, la mancanza di trattamenti efficaci. I primati non umani hanno la più vicina caratteristiche generali dello sviluppo dell'occhio a quello umano. Non solo hanno un simile anatomia vascolare, ma tra gli altri mammiferi, i primati hanno la caratteristica unica di avere una regione nella retina temporale specializzata di alta acuità visiva, la fovea
Protocol
Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti
- Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Si raccomanda che poco dopo il sacrificio gli occhi da iniettare con fissativo appena sotto la lente e conservate in fissativo.
- Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro).
Parte 2: rimozione del bulbo oculare dalla cavità orbitale
- Per facilitare l'accesso al bulbo oculare, si raccomanda di rimuovere prima il cervello. Una volta che il cervello è stata rimossa la parete sottile osso orbita è evidente. Utilizzare il Rongeurs osso di chip lentamente la parete dell'orbita. Tagliare i muscoli oculari con un bisturi e rimuovere il tessuto connettivo dal bulbo oculare. Tagliare con cautela il nervo ottico, questo può essere usato negli studi di microscopia elettronica. Il bulbo oculare dovrebbe essere rilasciato dalla cavità orbitale.
Parte 3: Dissect la retina dalla oculare
- Posto l'occhio in una piastra di Petri con PBS per mantenere la retina si secchi. Un microscopio da dissezione o tavolo montato ingrandimento stativo è utile nella dissezione, ma non una necessità. Togliere la cornea tagliando la sclera vicino al perimetro della cornea, a livello della serrata con un paio di forbici a molla e rimuovere l'obiettivo con il forcipe.
- Utilizzare un pennello, pinze, forbici e molla per rimuovere la retina dalla sclera. Questo viene fatto separando la retina dalla sclera e poi tagliando la sclera via con le forbici. Si deve svolgere questo processo con piccoli incrementi in modo da non danneggiare o strappare il tessuto retinico. La sclera non è facilmente separato dal resto del nervo ottico con tanta cura tagliare la sclera attorno al nervo ottico.
- A questo punto della retina ha mantenuto la sua forma curva e deve essere appiattito per il campionamento. Prima di appiattimento della retina, il vitreo, che ha la consistenza di gelatina, possono essere rimosse in un grumo. Per appiattire la retina su un vetrino, fare parecchi tagli radiali con una lama di bisturi. Vitreo residuo può essere rimosso con ordinaria carta da filtro e un pennello. La strato di cellule gangliari della retina è esposta a questo punto quindi è imperativo essere gentile quando si rimuove il vitreo. Se il nervo ottico è ancora attaccato al disco ottico, togliere il nervo ottico, senza strappare la retina con un bisturi e un paio di forbici primavera. Questa è ora una retina montaggio flat (figura 1) e la fovea dovrebbe essere evidente come una macchia scura in direzione temporale / ventrale dal disco ottico.
Parte 4: Campionamento
- Ci sono una serie di opzioni per il campionamento della retina. Qui descriveremo la preparazione flatmount e campionamento isodentric. Per entrambe le procedure flatmount la retina con lo strato in fibra ottica di distanza dalla presentazione. Se l'intenzione è di esaminare la retina strato di cellule gangliari nella preparazione flatmount, è necessario rimuovere o candeggina l'epitelio pigmentato. Per rimuovere l'epitelio pigmentato usare un pennello leggermente per togliere una parte di questo livello, questa tende a danneggiare lo strato dei fotorecettori. Sbiancamento coinvolge ammollo la retina in soluzione di permanganato di potassio (0,25%) per 1 ora, il lavaggio in acqua distillata, e di compensazione in acido ossalico (5%) per 5 minuti 2.
- Se l'intenzione è di esaminare la distribuzione cellulare e la morfologia di ogni livello per tutta la retina, quindi si consiglia di campionamento isometrica della retina. La retina deve essere flatmounted su un vetrino e tenuto umido con PBS. Per il campionamento isometrica tagliare piccoli pezzi di tessuto equidistante dal disco ottico nel nasale, indicazioni temporali, inferiore e superiore (Figura 1). Non è necessario candeggina l'epitelio pigmentato in questa preparazione. Questi pezzi possono ora essere sezionato nel piano coronale con un criostato, vibratome o ultramicrotomo a seconda della domanda di ricerca. Per sezionamento criostato, i pezzi devono essere crioprotetti nel 30% di saccarosio durante la notte e congelato nel contesto di un mezzo di montaggio in ghiaccio secco. In alternativa, i campioni possono essere inclusi in agar e fette su un vibratome. Il criostato e preparati vibratome sarà resa affidabile sezioni sottili come 4 m. Se sezioni più sottili sono necessari (ad esempio per la preparazione del microscopio elettronico), è necessario preparare i campioni per i ultramicrotomo. Per fare questo, le sezioni devono essere post-fissati in tetrossido di osmio per 1 ora sotto il fumehood. Ciò è seguita da disidratazione in una serie graduata di etanolo (50, 70, 95, 95, 100, 100%) e ossido di propilene 100%. Il tessutoviene poi incorporato in Epon (embed-812 kit di embedding).
Parte 5: Risultati Rappresentante:
Nel nostro laboratorio, abbiamo regolarmente eseguire immunoistochimica sulla retina cryosectioned (Figura 2). In questo caso siamo interessati alla isodensità dei recettori dei cannabinoidi (CB1) nella retina dei primati. Abbiamo anche esaminare gli effetti dell'esposizione prenatale dell'etanolo sul sistema visivo dei primati. A tal fine, siamo interessati a densità cellulare e lo spessore del livello nella fovea e nella retina periferica. Per fare questo, abbiamo incorporare pezzi di retina in Epon, fetta a 700 nm su un ultramicrotomo, e colorare con blu di toluidina 1% (Figura 3).
Figura 1 Retina Flatmount. Tagli radiali sono utilizzati per appiattire la retina.
Figura 2 immunocolorazione. Cryosection della retina periferica immunostained per CB1 dove le cellule gangliari della retina sono pesantemente etichettati con etichette negli strati interni ed esterni nucleare. Lo spessore di questa sezione è di 14 metri e colorato nella diapositiva. RG - strato retinico ganglio; IP - strato plessiforme interno; IN - interno strato nucleare; OP - strato esterno plessiformi; ON - strato esterno nucleare.
Figura 3 Fovea. Sezione attraverso la fovea che è stato incorporato in Epon e fette su un ultramicrotrome a 700nm. Lo strato dei fotorecettori (PR) è stato utilizzato per allineare le sezioni. Si noti che l'intera estensione dei fotorecettori possono essere identificati indicando un angolo appropriato sul piano coronale. Misure di densità sono stati prelevati a 300 m, 500 m, e 800 m dal centro della fossa foveale utilizzando il sistema Bioquant Imaging.
RG - strato retinico ganglio; IP - strato plessiforme interno; IN - interno strato nucleare; OP - strato esterno plessiformi; ON - strato esterno nucleare; barra di scala = 50 m
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Discussion
La preparazione della retina come un wholemount permette l'analisi della topografia e la distribuzione spaziale di uno strato di cellule gangliari o le cellule endoteliali dei vasi sanguigni della retina 3. Quantificazione della densità delle cellule nella periferia della retina dei primati è prontamente realizzato. Tuttavia, nelle regioni perifoveal e della fovea, la sovrapposizione degli strati multipli nello strato delle cellule gangliari ostacola quantificazione. Per aggirare questo pregiudizio potenziale, la fovea e regione perifoveal può essere sezionato dalla preparazione wholemount, incorporato in Epon, e sezionati in serie usando un ultramicrotomo di ottenere semi-sottili sezioni sul piano coronale 2,4. Ci sono una serie di altri svantaggi alla preparazione wholemount, che possono essere superati con paradigmi di campionamento alternative.
Il prelievo di campioni isometrica dalla retina e sezionamento nel piano coronale sia su un criostato o vibratome permette di esame specifico dei diversi strati, che non può essere facilmente eseguito su una preparazione wholemount. Sezionamento in questo modo consente anche l'applicazione di protocolli multipli immnohistochemistry 5. Queste sezioni possono poi essere rimosse dalla diapositiva, incorporato in Epon e fette su un ultramicrotomo. Con una modifica ultramicrotomo minore dell'angolo di taglio può essere fatto per assicurare un piano standard coronale attraverso i fotorecettori. Una volta che un aereo di serie è stato ottenuto, lo spessore dello strato può essere misurato e confrontato tra le regioni della retina e soggetti. Inoltre, Epon tessuto incorporato può essere utilizzato negli studi di microscopia elettronica di rivelare le caratteristiche ultrastrutturali della retina 6.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo supporto tecnico. Siamo grati a Frank Ervin, Roberta Palmour e il personale del Behavioural Sciences Laboratories Fondazione situato a St Kitts, nelle Indie Occidentali, per il supporto continuo del nostro lavoro primati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
