Summary
Le primate non-humain est une espèce importante translationnelle pour notre compréhension du développement et du vieillissement. L'organisation anatomique de la rétine des primates peuvent fournir des indications importantes sur les conditions normales et pathologiques chez l'homme.
Abstract
Le système visuel chez l'homme est considéré comme la passerelle vers le monde et joue un rôle principal dans la pléthore de sensorielle, les processus perceptifs et cognitifs. Il n'est donc pas surprenant que la qualité de la vision est liée à la qualité de vie. Malgré des recherches cliniques et fondamentales généralisé entourant les causes de troubles visuels, de nombreuses formes de déficiences visuelles, telles que la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire, le manque de traitements efficaces. Les primates non humains ont le plus proche caractéristiques générales du développement de l'œil à celui des humains. Non seulement ils ont une anatomie similaire vasculaire, mais parmi les autres mammifères, les primates ont la caractéristique unique d'avoir une région de la rétine temporale spécialisés pour l'acuité visuelle élevée, la fovéa
Protocol
Partie 1: Pré-traitement des tissus
- Les tissus doivent être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d'autres organes. Il est recommandé que, peu après le sacrifice des yeux être injecté avec fixateur juste sous la lentille et stockés dans un fixateur.
- Dans l'étude actuelle, l'objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu'à ce que complètement exsangue. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre).
Partie 2: Suppression de l'œil de la cavité orbitaire
- Pour faciliter l'accès à l'œil, il est recommandé d'enlever d'abord le cerveau. Une fois que le cerveau a été enlevée de l'os en orbite à paroi mince est évident. Utilisez la pince gouge os à ronger lentement la paroi de l'orbite. Coupez les muscles oculaires avec un scalpel et retirez le tissu conjonctif du globe oculaire. Découpez soigneusement le nerf optique, ce qui peut être utilisée dans les études de microscopie électronique. Le globe oculaire devrait maintenant être libéré de la cavité orbitaire.
Partie 3: Disséquer la rétine de l'œilleton
- Placez l'oeil dans une boîte de Pétri avec du PBS pour maintenir la rétine de sécher. Un microscope à dissection ou sur une table se loupe lumière est utile dans la dissection, mais pas une nécessité. Retirez la cornée en coupant la sclérotique près du périmètre de la cornée au niveau de l'ora serrata avec une paire de ciseaux à ressort et enlever la lentille avec la pince.
- Utilisez un pinceau, des pinces, des ciseaux et de printemps pour enlever la rétine de la sclère. Cela se fait en séparant la rétine de la sclère, puis couper la sclère écart avec les ciseaux. Il faut mener à bien ce processus dans de petits incréments afin de ne pas endommager ou déchirer le tissu rétinien. La sclérotique n'est pas facilement séparées du reste du nerf optique si soigneusement coupé la sclère autour du nerf optique.
- A ce point de la rétine a conservé sa forme incurvée et doit être aplatie pour l'échantillonnage. Avant aplatissement de la rétine, l'humeur vitrée, qui a la consistance de la gelée, peuvent être retirés dans un morceau. Pour aplatir la rétine sur une diapositive, faire plusieurs coupures radiales avec une lame de bistouri. L'humeur vitrée résiduelle peut maintenant être enlevée avec du papier filtre ordinaire et d'un pinceau. La couche de cellules ganglionnaires de la rétine est exposée à ce point il est donc impératif d'être doux pour retirer le corps vitré. Si le nerf optique est encore attaché à la papille optique, retirez le nerf optique, sans déchirure de la rétine à l'aide d'un scalpel et d'une paire de ciseaux à ressort. C'est désormais une rétine support plat (figure 1) et la fovéa devrait être évident que une tache sombre dans la direction temporelle / ventrale du disque optique.
Partie 4: Échantillonnage
- Il ya un certain nombre d'options pour le prélèvement de la rétine. Ici, nous allons décrire la préparation et l'échantillonnage flatmount isodentric. Pour les deux procédures flatmount la rétine avec la couche de fibres optiques loin de la glissière. Si l'intention est d'examiner la couche de cellules ganglionnaires de la rétine dans la préparation flatmount, il est nécessaire de supprimer ou eau de Javel l'épithélium pigmenté. Pour enlever l'épithélium pigmenté utiliser un pinceau légèrement pour enlever une partie de cette couche, ce qui tend à endommager la couche des photorécepteurs. Blanchiment consiste à tremper dans une solution de la rétine de permanganate de potassium (0,25%) pendant 1 heure, laver à l'eau distillée, et la compensation de l'acide oxalique (5%) pendant 5 minutes. 2
- Si l'intention est d'examiner la distribution de cellules et la morphologie de chaque couche à travers la rétine, alors nous vous suggérons d'échantillonnage isométrique de la rétine. La rétine doit être flatmounted sur une lame et maintenu humide avec du PBS. Pour l'échantillonnage isométrique coupé de petits morceaux de tissus à égale distance de la papille optique dans le nez, les directions temporelles, supérieure et inférieure (Figure 1). Il n'est pas nécessaire de blanchir l'épithélium pigmenté dans cette préparation. Ces pièces peuvent désormais être sectionnée dans le plan frontal avec un cryostat, vibratome ou ultramicrotome en fonction de la question de recherche. Pour sectionner cryostat, les pièces doivent être cryoprotégés de saccharose à 30% du jour au lendemain et congelé dans le contexte d'un milieu de montage sur glace sèche. Alternativement, les échantillons peuvent être intégrés dans l'agar et tranché sur une vibratome. Le cryostat et préparations vibratome de manière fiable le rendement des sections aussi fine que 4 m. Si des sections plus minces sont nécessaires (par exemple pour la préparation au microscope électronique), il est nécessaire de préparer les échantillons pour les ultramicrotome. Pour ce faire, les sections doivent être post-fixe dans le tétroxyde d'osmium pendant 1 heure sous la hotte. Elle est suivie par une déshydratation dans une série d'éthanol à (50, 70, 95, 95, 100, 100%) et l'oxyde de propylène de 100%. Le tissuest incorporé dans l'Epon (Embed-812 Kit incorporation).
Partie 5: Résultats du représentant:
Dans notre laboratoire, nous avons l'habitude de réaliser immunohistochimie sur la rétine cryosectioned (figure 2). Dans ce cas, nous sommes intéressés à l'isodensité des récepteurs cannabinoïdes (CB1) dans la rétine des primates. Nous examinons également les effets de l'exposition prénatale éthanol sur le système visuel des primates. À cette fin, nous sommes intéressés à la densité des cellules et l'épaisseur de la couche dans la fovéa et de la rétine périphérique. Pour ce faire, nous intégrons des morceaux de la rétine dans l'Epon, tranche à 700nm sur un ultramicrotome, et tacher avec 1% de bleu de toluidine (figure 3).
Retina Figure Flatmount 1. Coupes radiales sont utilisés pour aplatir la rétine.
Figure 2 Immunocoloration. Cryosection de rétine périphérique immunocolorées pour CB1 où les cellules ganglionnaires de la rétine sont fortement étiqueté avec la mention de certains dans les couches intérieure et extérieure nucléaire. L'épaisseur de cette section est de 14 m et colorées sur la diapositive. RG - couche ganglionnaires de la rétine; IP - couche plexiforme interne; EN - couche intérieure nucléaire; OP - couche externe plexiforme; ON - couche externe nucléaire.
Figure 3 Fovea. Section à travers la fovéa qui a été incorporé dans l'Epon et tranché sur une ultramicrotrome à 700nm. La couche des photorécepteurs (PR) a été utilisé pour aligner les sections. Notez que toute l'étendue des photorécepteurs peuvent être identifiées en indiquant un angle approprié dans le plan coronal. Les mesures de densité ont été prises à 300 m, 500 m et 800 m du centre de la fosse fovéale utilisant le système d'imagerie Bioquant.
RG - couche ganglionnaires de la rétine; IP - couche plexiforme interne; EN - couche intérieure nucléaire; OP - couche externe plexiforme; ON - couche externe nucléaire; barre d'échelle = 50 m
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Discussion
La préparation de la rétine comme un wholemount permet l'analyse de la topographie et la répartition spatiale soit de la couche des cellules ganglionnaires ou les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins de la rétine 3. La quantification de la densité cellulaire dans la périphérie de la rétine des primates est facilement réalisée. Cependant, dans les régions et les périfovéolaires fovéale, l'empilement de couches multiples dans la couche des cellules ganglionnaires obstrue la quantification. Pour contourner ce biais potentiel, la fovéa et de la région périfovéolaires peuvent être disséqués par la préparation wholemount, incorporé dans l'Epon et coupes sériées en utilisant un ultramicrotome pour obtenir coupes semi-fines dans le plan frontal 2,4. Il ya un certain nombre d'autres inconvénients à la préparation wholemount, qui peut être surmonté avec des paradigmes alternatifs d'échantillonnage.
Prélèvement d'échantillons isométrique de la rétine et de sectionnement dans le plan frontal soit sur un cryostat ou vibratome permet un examen précis des différentes couches, qui ne peuvent pas être facilement effectué sur une préparation wholemount. Sectionnement de cette manière permet également l'application de protocoles multiples immnohistochemistry 5. Ces sections peuvent ensuite être retirés de la diapositive, embarqué dans l'Epon et tranché sur une ultramicrotome. Avec un changement mineur dans ultramicrotome l'angle de coupe peuvent être faits pour assurer un plan standard coronal travers les photorécepteurs. Une fois un avion standard a été obtenue, l'épaisseur de couche peut être mesurée et comparée entre les régions de la rétine et des sujets. Par ailleurs, Epon embarqué tissu peut être utilisé dans les études de microscopie électronique à révéler les caractéristiques ultrastructurales de la rétine 6.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito support technique. Nous sommes reconnaissants à Frank Ervin, Roberta Palmour et le personnel des laboratoires de sciences du comportement de la Fondation situé à St-Kitts, dans les Antilles, pour leur soutien continu de notre travail primates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
