Summary
गैर मानव प्राइमेट विकास और उम्र बढ़ने की हमारी समझ के लिए एक महत्वपूर्ण translational प्रजातियों है. रहनुमा रेटिना के संरचनात्मक संगठन को मनुष्यों में सामान्य और रोग की स्थिति में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.
Abstract
मानव में दृश्य प्रणाली दुनिया के लिए प्रवेश द्वार माना जाता है और संवेदी, अवधारणात्मक और संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं की अधिकता में एक प्रमुख भूमिका निभाता है. इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि दृष्टि की गुणवत्ता जीवन की गुणवत्ता से बंधा है. व्यापक नैदानिक और बुनियादी दृश्य विकारों के कारण आसपास के अनुसंधान के बावजूद, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा और धब्बेदार अध: पतन के रूप में इस तरह के दृश्य impairments के, के कई रूपों प्रभावी उपचार की कमी है. गैर मानव प्राइमेट आँख विकास के निकटतम इंसानों की है कि सामान्य सुविधाओं है. न केवल वे एक समान नाड़ी शरीर रचना विज्ञान है, लेकिन अन्य स्तनधारियों के बीच प्राइमेट लौकिक उच्च दृश्य तीक्ष्णता, fovea के लिए विशेष रेटिना में एक क्षेत्र होने की अनूठी विशेषता है
Protocol
भाग 1: पूर्व ऊतक के प्रसंस्करण
- टिश्यू अच्छी तरह से paraformaldehyde, glutaraldehyde, या formalin के साथ perfused होना चाहिए. यह मानक transcardial आमतौर पर अन्य अंगों की फसल के लिए इस्तेमाल किया छिड़काव के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. यह सिफारिश की है कि शीघ्र ही बाद बलिदान आँखें लगानेवाला साथ लेंस बस के नीचे इंजेक्शन और लगानेवाला में संग्रहीत.
- वर्तमान अध्ययन में विषय ketamine (10 मिग्रा / किग्रा, IM) हाइड्रोक्लोराइड, सोडियम pentobarbital (iv 25 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ अति euthanized के साथ गहराई से बेहोश किया गया था और 0.1 एम पीबीएस साथ transcardially perfused जब तक पूरी तरह से exsanguinated. यह पीबीएस में 5 मिनट (~ 1 लीटर) के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान द्वारा पीछा किया जाता है.
भाग 2: नेत्रगोलक की कक्षीय गुहा से हटाया
- नेत्रगोलक के लिए आसान पहुँच के लिए यह पहली बार मस्तिष्क हटाने की सिफारिश की है. एक बार मस्तिष्क हटा दिया गया है पतली दीवारों कक्षा हड्डी आसानी से स्पष्ट है. अस्थि rongeurs का प्रयोग धीरे धीरे दूर कक्षा की दीवार चिप. दूर एक स्केलपेल के साथ नेत्र की मांसपेशियों कट और नेत्रगोलक से संयोजी ऊतक निकालने. ध्यान से ऑप्टिक तंत्रिका कटौती, इस इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है. नेत्रगोलक अब कक्षीय गुहा से रिहा किया जाना चाहिए.
भाग 3: eyecup से रेटिना काटना
- पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश सूखने से रेटिना रखने में आंख रखें. एक विदारक माइक्रोस्कोप या तालिका घुड़सवार प्रकाश खड़े शीशा विच्छेदन में उपयोगी है, एक आवश्यकता नहीं है, लेकिन. श्वेतपटल निकट वसंत कैंची की एक जोड़ी के साथ ora serrata के स्तर पर कॉर्निया की परिधि को काटने के द्वारा कॉर्निया निकालें और संदंश के साथ लेंस निकालने.
- एक तूलिका, संदंश, और वसंत कैंची का प्रयोग श्वेतपटल से रेटिना हटायें. यह श्वेतपटल से अलग रेटिना और फिर श्वेतपटल कैंची से दूर काटने के द्वारा किया जाता है. एक छोटे वेतन वृद्धि में इस प्रक्रिया इतनी के रूप में क्षति के लिए नहीं है या रेटिना ऊतक आंसू उठाने चाहिए. श्वेतपटल शेष ऑप्टिक तंत्रिका से आसानी से अलग नहीं है इसलिए सावधानी से ऑप्टिक तंत्रिका आसपास श्वेतपटल में कटौती.
- इस बिंदु पर रेटिना अपने घुमावदार आकार को बनाए रखा है और नमूने लिए चपटा की जरूरत है. रेटिना सपाट से पहले, शीशे हास्य, जो जेली की निरंतरता है एक गांठ में हटाया जा सकता है. किसी स्लाइड पर रेटिना को समतल करने के लिए, एक स्केलपेल ब्लेड के साथ कई रेडियल कटौती करने. अवशिष्ट कांच का हास्य अब साधारण फिल्टर पेपर और एक तूलिका के साथ हटाया जा सकता है. रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत में इस बिंदु पर संपर्क में है तो यह कोमल हो जब शीशे हास्य हटाने के लिए जरूरी है. यदि ऑप्टिक तंत्रिका ऑप्टिक डिस्क पर अभी भी जुड़ा हुआ है, एक स्केलपेल ब्लेड और वसंत कैंची की एक जोड़ी का उपयोग रेटिना तेजस्वी बिना ऑप्टिक तंत्रिका को हटा दें. यह अब एक फ्लैट माउंट रेटिना (चित्रा 1) है और fovea ऑप्टिक डिस्क से अस्थायी / वेंट्रल दिशा में एक अंधेरे पैच के रूप में स्पष्ट किया जाना चाहिए.
भाग 4: नमूनाकरण
- वहाँ रेटिना नमूना लेने के लिए विकल्पों में से एक नंबर रहे हैं. यहाँ हम flatmount तैयारी और isodentric नमूने का वर्णन करेंगे. दोनों प्रक्रियाओं के लिए ऑप्टिक फाइबर स्लाइड से दूर परत के साथ रेटिना flatmount. अगर इरादा flatmount तैयारी में रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत की जांच की है, यह आवश्यक है या तो हटाने या ब्लीच pigmented उपकला. हटायें pigmented उपकला एक तूलिका हल्के का उपयोग करने के लिए इस परत के कुछ दूर, इस फोटोरिसेप्टर परत को नुकसान पहुंचा जाता है. विरंजन पोटेशियम permanganate समाधान (0.25%) में 1 घंटे के लिए रेटिना, भिगोने आसुत पानी में धोने, और 5 मिनट के लिए oxalic एसिड (5%) में समाशोधन शामिल 2.
- यदि इरादा सेल वितरण और प्रत्येक परत के रेटिना भर आकारिकी की जांच करने के लिए है, तो हम रेटिना की isometric नमूने सुझाव देते हैं. रेटिना एक स्लाइड पर flatmounted होना चाहिए और पीबीएस के साथ नम रखा. Isometric नमूने के लिए नाक, अस्थायी, ऊपरी और निचले दिशाओं (चित्रा 1) में ऑप्टिक डिस्क से समदूरस्थ ऊतक के छोटे टुकड़े काट. यह इस तैयारी में pigmented उपकला ब्लीच करने के लिए आवश्यक नहीं है. ये टुकड़े अब राज्याभिषेक विमान में एक cryostat, vibratome, या ultramicrotome अनुसंधान सवाल पर निर्भर करता है के साथ sectioned किया जा सकता है. Cryostat सेक्शनिंग टुकड़े 30% रातोंरात sucrose में cryoprotected होना चाहिए और सूखी बर्फ पर बढ़ते माध्यम के संदर्भ में जमे हुए. वैकल्पिक रूप से, नमूने अगर में एम्बेड किया जा सकता है और एक vibratome पर कटा हुआ. cryostat और vibratome तैयारी मज़बूती से 4 मीटर के रूप में पतली के रूप में वर्गों निकलेगा अगर पतली वर्गों (जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की तैयारी के लिए) आवश्यक हैं, यह आवश्यक है ultramicrotome के लिए नमूने तैयार करने के लिए. ऐसा करने के लिए, वर्गों के बाद तय आज़मियम tetroxide में fumehood से कम 1 घंटे के लिए किया जाना चाहिए. यह एक वर्गीकृत श्रृंखला में इथेनॉल निर्जलीकरण (50, 70, 95, 95, 100, 100%) और 100% propylene ऑक्साइड के द्वारा पीछा किया जाता है. ऊतकतो EPON में एम्बेडेड (एम्बेड-812 एम्बेडिंग किट).
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:
हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से cryosectioned retinae (चित्रा 2) पर immunohistochemistry करते हैं. इस मामले में हम रहनुमा रेटिना में cannabinoid रिसेप्टर्स (CB1) isodensity में रुचि रखते हैं. हम भी रहनुमा दृश्य प्रणाली पर जन्म के पूर्व का इथेनॉल जोखिम के प्रभावों की जांच. यह अंत करने के लिए, हम और fovea और परिधीय रेटिना में सेल परत मोटाई घनत्व में रुचि रखते हैं. यह पूरा करने के लिए, हम EPON में रेटिना के टुकड़े एम्बेड करते हैं, 700nm पर एक ultramicrotome पर टुकड़ा है, और 1% toluidine नीले (चित्रा 3) के साथ दाग.
चित्रा 1 Flatmount रेटिना रेडियल कटौती करने के लिए रेटिना को समतल किया जाता है .
चित्रा 2 Immunostaining. परिधीय रेटिना के Cryosection CB1 जहां रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं भारी आंतरिक और बाहरी परमाणु परतों में कुछ लेबलिंग के साथ लेबल रहे हैं के लिए immunostained. इस खंड की मोटाई 14 और मीटर स्लाइड पर दाग है. आरजी - रेटिना नाड़ीग्रन्थि की परत, आईपी - भीतरी plexiform परत; में - भीतर परमाणु परत, ओ.पी. - बाहरी plexiform परत, बाहरी परमाणु परत.
चित्रा fovea कि EPON में एम्बेडेड था और 700nm में एक ultramicrotrome पर कटा हुआ के माध्यम से 3 fovea धारा. फोटोरिसेप्टर परत (पीआर) वर्गों को संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सूचना है कि photoreceptors के पूरे हद राज्याभिषेक विमान में एक उपयुक्त कोण का संकेत पहचाना जा सकता है. घनत्व माप 300 मीटर, 500 मीटर, और foveal Bioquant इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर गड्ढे के केंद्र से 800 मीटर की ऊंचाई पर ले जाया गया.
आरजी - रेटिना नाड़ीग्रन्थि की परत, आईपी - भीतरी plexiform परत; में - भीतर परमाणु परत, ओ.पी. - बाहरी plexiform परत, बाहरी परमाणु परत, पैमाने बार = 50 मीटर
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Discussion
wholemount के रूप में रेटिना की तैयारी स्थलाकृति और या तो नाड़ीग्रन्थि सेल परत या रेटिनल रक्त वाहिकाओं 3 के endothelial कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. रहनुमा रेटिना की परिधि में सेल घनत्व की मात्रा का ठहराव आसानी से पूरा किया है. तथापि, perifoveal और foveal क्षेत्रों में, नाड़ीग्रन्थि सेल परत में कई परतों के stacking की मात्रा का ठहराव भी नुकसान पहुँचा है. इस संभावित पूर्वाग्रह को दरकिनार करने के लिए, fovea और perifoveal क्षेत्र wholemount तैयारी से dissected किया जा सकता है, EPON में एम्बेडेड है, और serially sectioned एक ultramicrotome का उपयोग करने के लिए राज्याभिषेक 2,4 विमान में अर्द्ध पतली वर्गों प्राप्त है. Wholemount तैयारी, जो वैकल्पिक नमूना मानदंड के साथ दूर किया जा सकता करने के लिए अन्य नुकसान के एक नंबर रहे हैं.
रेटिना से isometric नमूने लेना और या तो एक cryostat या vibratome पर राज्याभिषेक विमान में सेक्शनिंग विभिन्न परतों, जो आसानी से एक wholemount तैयारी पर नहीं किया जा सकता है विशिष्ट परीक्षा के लिए अनुमति देता है. इस तरीके में सेक्शनिंग भी कई immnohistochemistry 5 प्रोटोकॉल के आवेदन के लिए अनुमति देता है . इन वर्गों तो स्लाइड से हटाया जा सकता है हो सकता है, EPON में एम्बेडेड है और एक ultramicrotome पर कटा हुआ. Ultramicrotome काटने कोण में एक मामूली परिवर्तन के साथ photoreceptors के माध्यम से एक मानक राज्याभिषेक विमान सुनिश्चित किया जा सकता है. एक बार एक मानक विमान प्राप्त किया गया है, परत मोटाई और मापा जा सकता है रेटिना क्षेत्रों और विषयों के बीच तुलना. इसके अलावा, EPON एम्बेडेड ऊतक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन में इस्तेमाल किया जा 6 रेटिना के ultrastructural विशेषताओं प्रकट कर सकते हैं.
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Acknowledgments
लेखकों के लिए अपनी तकनीकी सहायता के लिए Ikiel Ptito धन्यवाद देना चाहूंगा. हम फ्रैंक Ervin, रोबर्टा Palmour व्यवहार विज्ञान फाउंडेशन सेंट किट्स में स्थित प्रयोगशालाओं, वेस्ट इंडीज, और हमारे रहनुमा काम के अपने निरंतर समर्थन के लिए कर्मचारियों के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Any surgical scissors are sufficient |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09-924-150 | |
| Camel or Sable Hair paintbrush | Any Supplier |
References
- Hendrickson, A., Kupfer, C. The histogenesis of the fovea in the macaque monkey. Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).
- Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus). J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).
- Stone, J. The Wholemount Handbook. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).
- Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys. Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).
- Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).
- Pow, D., Sullivan, R. Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina. Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).
