Summary
يمكن للمنظمة التشريحية للدماغ الرئيسيات توفير معلومات هامة في الظروف العادية والمرضية لدى البشر. التجسيم هو أسلوب غير متحيز لبدقة وكفاءة تقدير عدد الخلايا العصبية الكلي (أو غيرها من نوع من الخلايا) في الفضاء مرجعية محددة
Abstract
الرئيسيات غير البشرية هي الأنواع الهامة متعدية لفهم وظيفة عادية والمرض عمليات في الدماغ البشري. التجسيم غير منحازة ، وطريقة مقبولة باعتبارها دولة من أحدث طراز لالكمي للكائنات بيولوجية في أقسام الأنسجة
Protocol
وينبغي أن يتم قبل معالجة الأنسجة وفقا لبيرك وآخرون : الجزء 1. (2009) 5.
- باختصار ، ينبغي أن الأنسجة perfused جيدا مع بارافورمالدهيد ، غلوتارالدهيد ، أو الفورمالين. ويمكن تحقيق ذلك من خلال نضح transcardial القياسية المستخدمة عادة لحصاد الأجهزة الأخرى. في هذه الدراسة كان مخدرا بعمق هذا الموضوع مع هيدروكلوريد الكيتامين (10 ملغم / كغم ، IM) ، الموت الرحيم مع جرعة زائدة من (الرابع 25 ملغ / كلغ ،) والصوديوم بنتوباربيتال perfused transcardially مع PBS 0،1 M حتى exsanguinated تماما. ويعقب ذلك من خلال حل بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق (~ 1 ليتر). وينبغي أن الأنسجة perfused جيدا مع paraformaldeyhde ، gluteraldehyde ، أو الفورمالين. وينبغي حظر stereotaxically الدماغ ، إزالتها من الجمجمة ، وزنه ، وحجم محدد ، cryoprotected ، والمجمدة 5.
الجزء 2 : أخذ عينات من أنسجة المنهجي ، وفقا لبيرك وآخرون. (2009) 6.
- في هذا المثال ركزنا على الفص الجبهي من الدماغ الفرفت. تم تعريف الفضاء المرجعي لتشمل الأنسجة القشرية من التلم المركزي إلى القطب الجبهي لنصف الكرة المخية الأيسر. لأغراضنا وضعت هذه السلسلة في 1 / 10 أقسام في جميع أنحاء القشرة ، مقطوع في 50μm. وكان الملون سلسلة واحدة كاملة مع البنفسجي cresyl (سلسلة رقم 1). تم تقسيم سلسلة 2 بحيث كانت ملطخة أن نصف من المقاطع مع كلوريد الذهب الوحي الميلين والنصف الآخر لالملون استريز أستيل (لترسيم المناطق تحت القشرية معينة). وقد راهن كل سلسلة أخرى في الحفاظ على مستضد كجزء من خططنا البحثية الطويلة الأجل.
الجزء 3 : التجسيم (لمزيد من التفاصيل ، انظر موتون 2002) 4
- يحسب تقدير مجموع أعداد الخلايا (N) على أساس المعادلة التالية :
N = س -1 SSF ASF -1 س س Σ TSF -1 س --
SSF حيث هو جزء المعاينة المقطع ، محامون بلا حدود هو جزء المعاينة المنطقة ، TSF إذا أخذ العينات جزء سمك (حيث يتم تقسيم قياس سماكة من النسيج من ارتفاع مشرح) ، وس Σ -- هو العدد الإجمالي للقطع الفائدة تحتسب داخل مشرح. المقاطع التالية من هذا البروتوكول إظهار كيفية تحديد SSF ، محامون بلا حدود ، وTSF Σ س. - قسم كسر المعاينة (غير القائم على الكمبيوتر)
- يجب أن يكون مرجع كامل مساحة محددة جيدا من الأمامي إلى الخلفي وظهري إلى بطني. في هذا المثال نحن مهتمون في الفص الجبهي وعرفتها بأنها المنطقة من غيض من القطب الجبهي (الأمامي) إلى التلم المركزي (الخلفي) والتلم الوحشي (البطنية) واستبعاد insula.
- الفص الجبهي لهذا الموضوع بالذات تم جمعها بصورة منتظمة ما مجموعه 760 من المقاطع مع 76 الملون لcresyl البنفسجي. منذ ان الهدف كان 10 أقسام في جميع أنحاء الفضاء المرجعية وأخذت عينات من 1 / 6 أقسام البنفسجي cresyl الملون ، مما أدى إلى كسر الباب عينة من حوالي 1 / 60. بدأنا بشكل عشوائي مع واحدة من 6 cresyl first أقسام البنفسجي الملون وأخذ عينات بشكل منتظم 06/01 بعد ذلك. وأخذت عينات من ما مجموعه 13 بابا لهذا الموضوع المحدد (الشكل 2).
منطقة الكسر نموذج (القائم على الحاسوب)- وهناك دراسة رائدة تدل على حجم الشبكة الأمثل ، وأخذ العينات كسر المنطقة ، لأخذ عينات من الفضاء المرجعي disectors 100-300 تقريبا. داخل الفص الجبهي ، أسفرت عن حجم الشبكة من 2500 بمتوسط 2 ميكرومتر من 254 disectors لهذا الموضوع (الشكل 2). وينبغي أن حجم العائد disector بين حوالي 0-5 الكائنات عدها ، في هذه الحالة ، الخلايا العصبية.
- سمك الكسر نموذج (القائم على الحاسوب)
- في كل موقع disector ، يتم قياس ارتفاع الأنسجة ، وعينات من جزء من هذا الارتفاع ، وهو ما يعرف في السماكة الكسر أخذ العينات. لتحديد سماكة يقاس ، من خلال التركيز على Z - الطائرة حتى الخلية الأولى ويأتي في التركيز ، ثم احتياطي قليلا إلى أعلى من هذا الباب ، أي حتى يظهر الكائن الأخير للتو من التركيز. لتحديد الجزء السفلي من الأنسجة ، من خلال التركيز ض الطائرة حتى الخلايا هي بالكاد من التركيز.
- من خلال التركيز ض الطائرة ، ينبغي ملطخة الخلايا في كل عمق ، وإذا تعذر ، وهذا قد يشير إلى اختراق من الجفاف غير مكتملة أو غير وصمة عار الزي العسكري من النسيج ، وفي هذه الحالة يجب أن تكون المقاطع إعادة الملون. هذه الاحتياطات هي أهمية خاصة بالنسبة للأنسجة immunostained يتطلب اختراق immunoprobes من خلال المقاطع الأنسجة سميكة نسبيا. لهذا السبب ، ينبغي الأنسجة immunostained counterstained باستخفاف مع قعد وصمة عار (البنفسجي ، على سبيل المثال cresyl ، هيماtoxylin) من أجل تحديد بدقة أعلى وأسفل الباب ، وتأكيد الاختراق من الأجسام المضادة. في هذه الدراسة كانت شرائح المقاطع في إعداد مشراح من 50μm. بعد كل معالجة الأنسجة وكاملة ، وبلغ متوسط سماكة الأنسجة تقاس 17.9μm (الشكل 2) ، مع انكماش يعني من حوالي 65 ٪. علما أن هذه النتائج تمثل انكماش الأنسجة نموذجية لمعالجة الروتين لإعداد النسيجية 7.
- ارتفاع disector الافتراضي للدراسة النموذجية 10μm. الفرق بين ارتفاع disector وسمك الباب قياسه هو ذروة الحرس ، وحجم الأنسجة حيث لا تحتسب الميزات البيولوجية. استخدام الحراسة على ارتفاع يتجنب تلف الأنسجة على السطوح sectioning (على سبيل المثال ، خسر مباراة دولية).
- العدد الكلي للكائنات عدها ، Σ س --
- لتجنب التحيز من الأخطاء الاعتراف ، فمن المحتم أن يتبع تعريف موحد للميزة بيولوجية معينة من الفائدة. في هذه الحالة ، ونحن مهتمون في عد الخلايا العصبية. ولذلك ، تم تعريف الخلية العصبية وجود نوية مرئية في موقع مركزي والسيتوبلازم واضحة المعالم ، في حين أن الخلايا الدبقية تفتقر عموما نويات واضحة والسيتوبلازم. عن هذا الموضوع احصي 457 الخلايا العصبية.
الجزء 4 : Stereologer -- نظام محوسب التجسيم (التجسيم مركز الموارد ، تشيستر ، MD)
- نظام Stereologer يطالب المستخدم لملء المعلومات الضرورية بطريقة خطوة بخطوة. في المقطع "دراسة المعلومات" وضعت معايير للدراسة. إذ لابد من تعريف الفضاء المرجعي للدراسة ، ينبغي تحديد حجم المعلمة (للمرجعية الفضاء يجب أن يكون محددا ومقدر كافاليري). ويمكن أيضا أن يكون حجم الكائن المحدد هنا لتقدير حجم عدد المرجحة للسكان من وجوه الفائدة. على سبيل المثال لدينا ، وقد تم اختيار فقط من حجم المساحة المرجعية. لكل كائن ، حدد عدد وتحديد سمة من الفائدة ، وهذه الخلايا العصبية في القضية.
- تهيئة القضية : وفي هذا القسم هو تأسيس قاعدة المعلومات أخذ العينات. أدخل الفاصل الزمني أخذ العينات بلاطة (إذا كانت شرائح ألواح منفصلة من الأنسجة باستفاضة ويوضع كل قسم بالترتيب 1 ثم أدخل هنا). أدخل عدد من الأبواب التي اتخذت من خلال الفضاء المرجعية (في هذه الحالة 760). ثم أدخل الفاصل الزمني أخذ العينات المقطع (في هذه الحالة 59). ثم يقوم النظام بحساب عدد الفروع لأخذ عينات (في هذه الحالة 13).
- المسبار معلمات : يحدد هذا الجزء الشبكة وحجم disector. لهذا المجلد ، استخدام التكبير منخفضة 2.5x - 10X لتحديد التباعد الشبكة ضمن القائمة تحرير. يجب أن يتم تنفيذ التكبير الكائن في 100X (NA 1.3 أو 1.4). منطقة الإطار هو حجم disector ، في هذه الحالة كنا شاشة 50 ٪. ارتفاع الإطار هو سمك disector ؛ وضعت في 10μm هنا. تباعد الإطار هو حجم الشبكة. في الدراسة التجريبية وجدنا أن لدينا 2500μm الغلة بين 150-200 إطارات متباعدة بطريقة منهجية موحدة من خلال مساحة كبيرة نسبيا المرجعية. لأصغر المناطق ، ينبغي استخدام الشبكة حجم أصغر. وهناك دراسة رائدة تحديد المعلمات البصرية لتحقيق كل دراسة خاصة.
- مرة واحدة وقد وضعت الدراسة المعلمات ، قد أخذ عينات الأنسجة من خلال المضي قدما. البرنامج سوف يطلب منك عينة المقطع الأول الخطوة 1 : برنامج سيدفع المستخدم ، تحت التكبير منخفضة ، لتتبع مرجعية الفضاء على الباب. سوف يقوم النظام ثم ضع شبكة على المقطع استنادا إلى معلمات التحقيق والتحقق من المستخدم وبعد ذلك نقطة تقع ضمن مساحة المرجعية. إذا كانت النقطة ليست ضمن المساحة المرجعية ببساطة انقر على نقطة ولن تكون محسوبة في حجم الخطوة 2 : وسوف يقوم النظام وضع شبكة جديدة على مساحة المرجعية ، استنادا إلى معلمات تباعد الإطار. تحقق من أن التقاطعات تقع ضمن المساحة المرجعية الخطوة 3 : يقوم النظام بعد ذلك سيدفع المستخدم للتبديل إلى هدف أعلى التكبير والانتقال إلى مرحلة مشرح أول خطوة 4 : عند هذه النقطة النظام بتنبيه المستخدم لتحديد أعلى وأسفل الباب ثم نظام يحدد مساحة المعاينة في الخطوة محور Z - 5 : المستخدم سوف ثم انقر على كل كائن التي تندرج ضمن disector من خلال Z - الطائرة. قد لا الكائنات التي تلمس خطوط حمراء أو الجزء السفلي من disector تحسب. مرة واحدة يتم احتساب كل كائن ، انقر فوق التالي. سيتم الانتقال الى المرحلة المقبلة والخطوات disector سوف تتكرر 4 و 5. مرة واحدة وقد تم فرز جميع disectors لهذا الباب ، فإن النظام سوف يدفع المستخدم لإدراج المقطع التالي لبحث متسلسلة. وسيتم تكرار الخطوات 1-5 حتى جميع الفروع ومتسلسلتم أخذ عينات منها. وسيوفر النظام ثم حسابات محامون بلا حدود ، SSF ، TSF ، وΣ س. على أساس هذه المعايير ، فإن إنشاء نظام N المقدرة ، والإشارة إلى حجم CE لعدد يقدر على حد سواء وحدة التخزين. فإنه سيتم أيضا إعطاء التوصيات لتصبح أكثر فعالية أو للحد من م (الشكل 2).
الجزء 5 : نتائج الممثل :
التجسيم تقديرات غير متحيزة تتسم بالكفاءة وموثوق بها من السكان خلية داخل فضاء المرجع. هناك عدد من النظم الحاسوبية stereological المتاحة ، وكلها تعتمد على أخذ عينات منتظمة وعلى مسافة مرجعية معينة. لقد استخدمنا نظام BioQuant علوم الحياة لتقدير عدد السكان من الخلايا العصبية في القشرة الدماغية من 2 عاما vervets إلى أن أكثر من 828 مليون نسمة (الشكل 3) مع متوسط قدره 0.042 م. وقد استخدمنا في وقت لاحق نظام Stereologer تقدير أن حسابات الفص الجبهي لحوالي نصف عدد الخلايا العصبية القشرية 8.
الشكل 1 أنظمة الكمبيوتر المستندة إلى التجسيم ، وانشاء الأساسية للنظم التجسيم هو نفسه ، المجهر مع مرحلة بمحركات (XYZ) ، وحدة تحكم المرحلة ، وكاميرا الفيديو ، والكمبيوتر ، والبرمجيات. وينبغي أن يستند هذا النظام الذي يتم اختياره في النهاية على الكفاءة ، والاحتياجات ، وتحليل التكاليف.
| دراسة المعلومات | |
| اسم الدراسة | اللحاء الجبهي |
| الباحث الرئيسي | MB |
| نوع | AG |
| مرجع الفضاء أمامي | قشرة |
| تلاحظ | |
| CASE معلومات | |
| جامع البيانات | MB |
| تاريخ | الأربعاء 30 أبريل ، 2008 |
| مجموعة | مراقبة |
| موضوع | O26 |
| تلاحظ | |
| أخذ العينات خصائصها | |
| بلاطة الفاصل الزمني أخذ العينات | 1 |
| مجموع عدد الأقسام | 760 |
| قسم المعاينة الفاصل | 59 |
| انطلاق القسم | 2 |
| الكسور | |
| ASF | 0.0002 |
| SlabSF | 1.0000 |
| SSF | 0.0169 |
| TSF | 0.5587 |
| ملخص النتائج | |||||
| المعلمة | مسبار | اسم | نتيجة | CE | SD |
| سماكة | --- | --- | 17.8996 μ | --- | --- |
| عدد | Disector | عصبون | 243833769.1473 | 0.0474 | N / A |
| حجم | كافاليري نقطة الشبكة | حجم | 1719769397954.1284 μ ^ 3 | 0.0078 | N / A |
| التوصيات | |
| مسبار | رقم الكائن (الخلايا العصبية) |
| CE | 0.0474 |
| التوصيات | CE غير مقبولة. |
| عدد Disectors عرض عالية جدا ، وزيادة التباعد Disector. | |
| مسبار | حجم المنطقة (حجم) |
| CE | 0.0078 |
| التوصيات | CE غير مقبولة. |
| قسم النتائج | ||
| مقطع | عصبون العصبون NumObjects NumCorners | حجم RegPoints |
| 1. 40 | 48 | 34 |
| 2. 26 | 52 | 44 |
| 3. 29 | 56 | 48 |
| 4. 39 | 100 | 83 |
| 5. 49 | 112 | 83 |
| 6. 53 | 156 | 120 |
| 7. 65 | 128 | 106 |
| 8. 45 | 108 | 100 |
| 9. 52 | 100 | 77 |
| 10. 26 | 64 | 60 |
| 11. 21 | 44 | 44 |
| 12. 11 | 36 | 32 |
| 13. 1 | 12 | 6 |
الرقم 2 من نتائج لوب Fontal حصل مع نظام Stereologer ، وللاطلاع على الفص الجبهي ، وهي أطول جزء من العملية stereological كان في أخذ العينات والمنهجية sectioning. تم الانتهاء من التضاريس ، وتقدير حجم والعصبية في يوم واحد حول كل موضوع. تم أخذ عينات من نصف الكرة المخية الأيسر ، وتضاعف العدد في النص إلى تقدير تقريبي لنصفي الكرة الأرضية.
الشكل 3 اللحاء تقديرات السكان متعلق بالخلايا العصبية التي يتم الحصول عليها مع BioQuant. BioQuant هذا النظام يتطلب وجود تضاريس الدقيقة قبل العد الخلية. وأخذت عينات من هنا في المتوسط من 13 أقسام. استغرق الطبوغرافيا القشرية واللاحقة تقدير حجم ما بين 15-20 ساعة لكل موضوع. تم تنفيذ التضاريس تحت 2.5x الهدف ، ويجري الفرز باستخدام الغمر النفط 100X الهدف (NA 1.3). وقد تم اختيار كل قسم 100 في جميع أنحاء نصف الكرة المخية الأيسر بمتوسط قدره 180 disectors العينة. بمجرد الانتهاء من العد العصبية الطبوغرافيا استغرق حوالي يوم واحد. تم أخذ عينات من نصف الكرة المخية الأيسر ، وتضاعف العدد في النص إلى تقدير تقريبي لنصفي الكرة الأرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التجسيم غير متحيز في دماغ الرئيسيات هي مماثلة لتلك العينات البيولوجية الأخرى. ومع ذلك ، نظرا لحجم الدماغ الرئيسيات ، فمن المستحسن وضع خطة معالجة متأنية منذ نصف الكرة الأرضية واحدة من قرد الفرفت الغلة أكثر من 1200 المقاطع عند شرائح في 50μm. أول نوصي حظر stereotaxically الدماغ إلى كتل 1cm ، والتي توفر الطائرة القياسية من الباب بين الكتل والموضوعات ، وتقلل من الفروع الجزئية بين الكتل ، ويوفر كتل التحكم بحجم 5. خطوة حاسمة لالتجسيم غير المنتظمة هذه العينات التي يتم الحصول عليها من خلال المقاطع 6-10 المنطقة المرجعية. الرئيسيات للدماغ ، وهذا يترك كمية كبيرة من المواد غير المصنعة ، وذلك من أجل تحقيق أقصى قدر من البيانات التي تم الحصول عليها من كل إمكانات الدماغ نقترح المصرفي في الأنسجة في الحفاظ على مستضد لخطط بحثية طويلة الأمد 6. عندما راهن الأنسجة ، ويمكن إعداد نهج مناعي منهجية لتحديد الهدف البروتينات في الدماغ عن قرد التجسيم 9. قد مناطق أكبر مثل القشرة أو الفص تتطلب 10-14 المقاطع ، قبل ذلك لsectioning ينبغي وضع خطة لديك على الأقل 10 أقسام أصغر مساحة من خلال مرجعية الفائدة المحتملة. وينبغي أيضا أن دراسة تجريبية أجريت على موضوع الرقابة لتعيين المعلمات لدراسة stereological. وعلاوة على ذلك عند تقديم أو تفسير البيانات stereological نشرت ينبغي الإبلاغ عن محامون بلا حدود ، TSF ، SSF ، وس Σ جنبا إلى جنب مع القيم CE المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر Ikiel Ptito لدعمه الفني المستمر. NSERC منحة لعضوية البرلمان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
