Summary
霊長類の脳の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することができます。公平な立体学が正確かつ効率的に所定の基準空間の合計ニューロンの数を（または他の細胞型）を推定するための方法です。
Abstract
ヒト以外の霊長類はヒトの脳の正常機能と疾患のプロセスを理解する上で重要な並進種です。公平な立体学、組織切片における生物学的なオブジェクトの定量化のための最先端のように受け入れられる方法
Protocol
パート1：組織の前処理が行われるのは、Burkeらによると行う必要があります。 （2009）5。
- 簡単に言えば、組織はよくパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。これは通常、他の臓器を収穫するために使用される標準transcardial灌流によって達成することができます。本研究では被験者は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静したペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流。これは、5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液が続いている。組織はよくparaformaldeyhde、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。脳が定位、ブロックされた頭蓋骨から削除すべきである、凍結保護、および5冷凍、、定める量を重量を量った。
第2部：組織の系統的サンプリング、Burkeらによると。 （2009）6。
- この例では、ベルベットモンキーの脳の前頭葉に焦点を当てた。参照のスペースは中央の溝から左半球の前頭極への皮質組織を含むように定義されていました。我々の目的のためにシリーズは50μmので切片化、皮質全体の10分の1のセクションに設定した。つの完全なシリーズは、クレシルバイオレット（シリーズ＃1）で染色した。シリーズ2は、分割されたので、セクションの半分は、ミエリンの啓示とアセチルコリンエステラーゼのための残りの半分のステンドグラス（特定の皮質下の領域の描写のため）のために金の塩化物で染色した。すべての他のシリーズは、当社の長期的な研究計画の一環として、抗原の保護区でバンクレジスタれた。
パート3：立体学（詳細については、ムートン2002を参照してください）4
- 細胞数の合計推定（N）は次式に基づいて計算されます。
N = SSF -1 xのASF -1 xのTSF -1 xのΣQ -
SSFは、セクションのサンプリングの割合です、ASFは、地域のサンプリング率、厚さのサンプリング割合に応じTSF（組織の測定された厚みがディセクタ高さで割ったされている場所）、およびΣQです-カウント対象となるオブジェクトの合計数です。解剖する人の中。このプロトコルの次のセクションでは、SSF、ASF、TSFとΣQを決定する方法を示します。 - 節のサンプリング分数（非コンピュータベース）
- 全体の基準のスペースは十分前方から後方と腹側の背側に定義する必要があります。この例では、前頭葉に興味を持っていたと前頭極（前方）の先端から中心溝（後方）と外側溝（腹側）までの領域として定義されており、島を除外しています。
- この特定の主題の前頭葉のために760のセクションの合計は、体系的にクレシルバイオレットで76ステンドグラスを収集した。ターゲットは、基準空間の全体にわたって10個のセクションだったので1月6日クレシルバイオレット染色された切片は1 / 60のセクションのサンプルの分画につながる、サンプリングされた。我々は、ランダムに最初の6クレシルバイオレットで染色したセクションのいずれかで開始し、体系的に、その後1 / 6サンプリング。 13セクションの合計は、選択対象（図2）のために採取した。
エリアのサンプル画（コンピューターベース）- パイロット研究では、約100から300 disectorsで参照空間をサンプリングするために、最適なグリッドサイズ、エリアサンプリングの分数を示します。前頭葉内に、2500μm2であるのグリッドサイズは、この主題は254 disectors（図2）の平均値が得られた。 disectorの大きさは、このケースでは、0から5まで約カウントオブジェクトの間の神経細胞を生成する必要があります。
- 厚さのサンプルのフラクション（コンピューターベース）
- 各disector場所で、組織の高さを測定し、この高さの割合は、サンプリングされ、これは厚さサンプリング分数として知られています。最後のオブジェクトにフォーカスが出たばかり表示されるまで測定された厚さを決定するために、最初のセルまで、z平面でフォーカスは、セクションの上部、すなわちにわずかにバックアップし、子音が鳴ります。細胞がボケがほとんどになるまで、組織の底を確認するには、z平面でフォーカス。
- z平面を通じて着目し、細胞はすべての深度で染色する必要がある、そうでない場合、これはセクションを再染色されるべき場合には、組織の染色または不均一な脱水の不完全浸透している可能性があります。この予防措置は、比較的厚い組織切片を通じてimmunoprobesの浸透を必要とする免疫染色組織のために特に重要です。このような理由から、免疫染色組織は軽く好塩基性染色（例えば、クレシルバイオレット、HEMAで対比されるべきであるtoxylin）正確にセクションの上部と底部を決定し、抗体の浸透性を確認するため。本研究ではセクションが50μmのミクロトーム設定でスライスされた。すべての組織の処理が完了した後、測定された組織の厚さは約65％の平均収縮で、17.9μm（図2）を平均した。これらの結果は、ルーチン組織プレパラート7で処理された組織の典型的な収縮を表すことに注意してください。
- 典型的な研究のためのデフォルトのdisectorの高さは、10μmである。 disector高さと測定されたセクションの厚みの違いは、ガードの高さは、生物学的機能がカウントされていない組織の体積である。ガードの高さを使用するには（例えば、失われたキャップ）のセクショニング面で組織の損傷を避けることができます。
- カウントされたオブジェクトの合計数、ΣQ -
- 認識誤りからのバイアスを避けるために、それは標準的な定義が関心のある特定の生物学的機能のために続いていることが不可欠です。このケースでは、我々は神経細胞を数えることにも興味があった。そのため、ニューロンがグリア細胞は、一般的に目に見える核小体と細胞質に欠けていたのに対し、目に見える中心部に位置する核小体と明確に定義された細胞質を持つものとして定義されました。この主題457ニューロンをカウントしたため。
パート4：Stereologer -コンピュータによる立体学系（立体学リソースセンター、チェスター、MD）
- Stereologerシステムは、ユーザーがステップバイステップ方式で必要な情報を記入するよう求められます。 "調査情報"のセクションでは研究のパラメータが確立されています。基準スペースが研究のために定義する必要があるため、ボリュームのパラメータは（参照のスペースのためカヴァリエリの推定量を選択する必要があります）を選択してください。オブジェクトのボリュームも関心のオブジェクトの集団の数加重量を推定するためにここで選択することができる。この例では、基準空間の唯一のボリュームが選択されました。各オブジェクトの場合は、番号を選択し、この場合のニューロンで、興味の機能を定義します。
- ケースの初期化：このセクションでは、サンプリングの情報が確立されている。スラブサンプリング間隔を（組織の別のスラブが徹底的にスライスされ、各セクションを順番に配置されている場合は、ここで1を入力）を入力します。基準スペース（この場合は760）を介して行わセクションの合計数を入力してください。その後、セクションのサンプリング間隔を（この場合59）を入力します。システムは、サンプリングされるセクション（この場合13）の数を計算します。
- プローブパラメータ：このセクションでは、グリッドとdisectorのサイズを定義します。ボリュームの場合は、編集メニューの下のグリッド間隔を定義するために2.5倍、10倍の低倍率を使用してください。オブジェクトの倍率は100倍（NA 1.3または1.4）で行ってください。フレーム領域は、disectorの大きさですこの場合、我々は50％のスクリーンを使用。フレームの高さはdisectorの厚さであり、ここで10μm以下に設定。フレームの間隔は、グリッドのサイズです。私たちのパイロットスタディでは、150から200フレームの間の2500μmの利回りが比較的大きな基準空間を体系的、統一的な方法で間隔をあけていることがわかった。小規模な地域については、より小さいグリッドサイズを使用する必要があります。パイロット研究では、各特定の研究のための光プローブのパラメータを識別します。
- 試験パラメータが確立されれば、組織を介してサンプリングすると、進むことができます。プログラムは最初のセクションをサンプリングするように要求されるステップ1：このプログラムは、セクションの参照領域をトレースするために、低倍率で、ユーザーに要求します。その後、システムはそのポイントが基準空間内に収まることを確認されるプローブのパラメータおよびユーザーに基づいて、セクションの上にグリッドを配置します。ポイントは基準空間内にない場合は、単にポイントをクリックすると、ボリュームに計算されませんステップ2：システムはフレームの間隔のパラメータに基づいて、基準空間上の新しいグリッドを配置します。交点は、基準空間内に収まることを確認してくださいステップ3：。。システムは、ユーザーがより高い倍率の目標に切り替え、最初のセクタにするためにステージを移動するプロンプトが表示されますは、 手順4：この時点でシステムはユーザが定義するプロンプトをセクションの上部と下部には、システムはz軸のサンプリング間隔を設定ステップ5：。その後、ユーザーは、z平面を通してdisector内にある各オブジェクトをクリックします。赤い線またはdisectorの底面に触れないオブジェクトはカウントされないことがあります。各オブジェクトがカウントされると、[次へ]をクリックします。ステージは次のdisectorと4と5が繰り返されるステップに移動します。一度、すべてのセクションに対してdisectorsのがカウントされている、システムは、検出対象に次の順番のセクションを挿入するようユーザーにプロンプトが表示されます。シーケンシャルセクションのすべてが完了するまでステップ1〜5が繰り返されます。サンプリングされた。システムは、ASF、SSF、TSF、及びΣQの計算を提供します。これらのパラメータに基づいて、システムは、基準量を推定Nを生成し、CEの推定数とボリュームの両方になります。また、より効率的になることやCE（図2）を削減する勧告を与える。
パート5：代表的な結果：
公平な立体学は、基準空間内の細胞集団の効率的かつ信頼性の高い推定値を提供します。システマティックサンプリングと定義されている基準空間に依存するすべてが利用可能なコンピュータベースの立体的システムの数があります。我々は、0.042の平均CEで828百万（図3）以上になる2歳のvervetsの大脳皮質の総神経人口を推定するためにBioQuantライフサイエンスシステムを使用している。私たちは、その後、前頭葉は皮質ニューロン8の約半分数を占めていると推定するStereologerシステムを使用している。
図1コンピュータベースの立体学システム。立体学システムの基本的なアップセットは、電動ステージ（XYZ）と同じ、顕微鏡、ステージコン トローラ、ビデオカメラ、コンピュータ、およびソフトウェアです。最終的に選択されているシステムは、効率性、必要性、およびコスト分析に基づいている必要があります。
| 検査情報 | |
| スタディ名 | 前頭皮質 |
| 治験責任医師 | メガバイト |
| 種 | AG |
| リファレンススペース前頭葉 | 皮質 |
| ノート | |
| ケース情報 | |
| データコレクタ | メガバイト |
| 日 | 年、2008年4月30日 |
| グループ | コントロール |
| 対象と | O26 |
| ノート | |
| サンプリング特性 | |
| スラブサンプリング間隔 | 1 |
| セクションの合計数 | 760 |
| 節のサンプリング間隔 | 59 |
| 始まるセクション | 2 |
| 分別 | |
| ASF | 0.0002 |
| SlabSF | 1.0000 |
| SSF | 0.0169 |
| TSF | 0.5587 |
| 結果の概要 | |||||
| パラメータ | プローブ | の名前 | その結果 | CE | SD |
| 厚 | --- | --- | 17.8996μ | --- | --- |
| 数 | Disector | ニューロン | 243833769.1473 | 0.0474 | N / |
| ボリューム | カヴァリエーリポイントグリッド | ボリュームを | 1719769397954.1284μ^ 3 | 0.0078 | N / |
| 勧告 | |
| プローブ | オブジェクト番号（ニューロン） |
| CE | 0.0474 |
| 推奨事項 | CEは許容範囲です。 |
| 閲覧Disectorsの数が多すぎると、Disector間隔を増やします。 | |
| プローブ | 地域の音量（ボリューム） |
| CE | 0.0078 |
| 推奨事項 | CEは許容範囲です。 |
| SECTIONの結果 | ||
| セクション | ニューロンNumObjectsニューロンNumCorners | ボリュームRegPoints |
| 1。 40 | 48 | 34 |
| 2。 26 | 52 | 44 |
| 3。 29 | 56 | 48 |
| 4。 39 | 100 | 83 |
| 5。 49 | 112 | 83 |
| 6。 53 | 156 | 120 |
| 7。 65 | 128 | 106 |
| 8。 45 | 108 | 100 |
| 9。 52 | 100 | 77 |
| 10。 26 | 64 | 60 |
| 11。 21 | 44 | 44 |
| 12。 11 | 36 | 32 |
| 13。 1 | 12 | 6 |
Stereologerシステムで得られた源泉のローブから図2の結果。前頭葉では、立体的プロセスの最も長い部分は、体系的なサンプリングとセクショニングにあった。地形、体積と神経細胞の推定値は、各科目の約1日で完了した。左半球を採取し数は両半球のおおよその見積もりにテキストを2倍に。
図3 BioQuantで得られた皮質神経人口推計。BioQuantシステムは前の細胞計数の正確な地形が必要です。その13セクションの平均値をサンプリングした。皮質地形とそれに続くボリュームの推定では、被験者ごとに15〜20時間の間にかかりました。地形は、2.5xの目的で行ったとカウントは、100倍油浸対物レンズ（NA 1.3）使用して行われました。すべての第百セクションは、サンプリングされた180 disectorsの平均と左半球全体に選ばれました。地形が完了した後は神経細胞のカウントは一日かかりました。左半球を採取し数は両半球のおおよその見積もりにテキストを2倍に。
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Discussion
霊長類の脳における公平な立体学は、他の生体試料のそれと似ています。しかし、霊長類の脳の大きさを考えると、慎重な処理計画が50μmの時にスライスするときにベルベットモンキーの単一の半球は、1200以上のセクションをもたらすので、推奨されます。まず、定位、ブロックおよびサブジェクト間のセクションの標準的な平面を提供するブロック間の部分的なセクションを最小限に抑え、かつ管理サイズのブロック5を提供する1センチメートルブロック、に脳をブロックすることを推奨します。立体学のための重要なステップは6-10セクションを参照領域を介して取得されるような体系的なサンプリングである。霊長類の脳では、これは我々は長期的な研究計画の6の保持抗原の組織をバンキング提案するそれぞれの脳から得られる潜在的なデータを最大限にするためにので、未処理材のかなりの量を残す。組織は、バンクされている場合、サルの脳内標的タンパク質を識別するための体系的免疫検出のアプローチは、立体学9で調製することができる。このような皮質や葉などの大きな領域は、その前の計画は潜在的な関心の最小基準空間を介して少なくとも10のセクションを持つようになされるべき切片に10〜14のセクションが必要な場合があります。パイロット調査は、立体的研究のためのパラメータを設定するための制御対象で実行する必要があります。さらに、提示または立体的データをASF、TSF、SSF、およびΣQを公開されて解釈するときは、適切なCEの値と一緒に報告すべきである。
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Acknowledgments
著者は、彼の継続的な技術サポートのためにIkiel Ptitoに感謝します。 MPにNSERC助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereologer | Stereology Resource Center (Chester, MD) | www.disector.com | |
| Stereology Tool-Kit Stereologer system | BioQuant Life Sciences (Nashville, TN) | ||
| StereoInvestigator | MBF Bioscience |
References
- West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec. 231, 482-497 (1991).
- Saper, C. B. Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods. J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).
- Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134, 127-136 (1984).
- Mouton, P. R. Principles and Practices of Unbiased Stereology. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2002).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space. J Vis Exp. 29, (2009).
- Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. Brain banking: Making the most of your research. J Vis Exp. 29, (2009).
- Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry. AGE. 29, 87-96 (2009).
- Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure. Neuroreport. 20, 13-17 (2009).
- Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain. J Vis Exp. 29, (2009).
